Технологија инактивације и уклањања вируса крвних продуката

Oct 24, 2024

Крвни производи су „компоненте протеина плазме или компоненте крвних зрнаца, као што су албумин људске крви, хумани имуноглобулин, хумани фактор коагулације (природни или рекомбинантни) концентрат црвених крвних зрнаца, итд., одвојени од здраве људске плазме или плазме особе са имунитетом, пречишћене или направљене технологијом рекомбинантне ДНК, за дијагнозу, терапију или пасивну имунопрофилаксију“. Крвни производи играју важну улогу у хитној медицинској помоћи, спасавању ратних повреда и превенцији и лечењу неких специфичних болести.

Пракса осигурања безбедности треба да осигура да је коначни лек безбедан за регулаторе и, на крају, за пацијенте и јавност. Током 1990-их, Међународна координациона конференција (ИЦХ 1998) издала је „К5А: Процена вирусне безбедности биотехнолошких производа ћелијских линија људског или животињског порекла“ (К5А: Процена вирусне безбедности), успостављајући светски стандард за вирусну безбедност.

ИЦХ К5А описује вишеслојну шему за тестирање и провјеру ваљаности како би се постигао овај циљ. Програм тестирања се фокусира на ћелијску банку, прикупљање сировина и биореактора, допуњено анализом ризика производа. Поред тестирања, ИЦХ К5А захтева да се низводна деконтаминација процени као мера без грешке када се узводно не детектују загађивачи. Верификација одобрења осигурава да, ако било који вирус избегне режим тестирања, може бити уклоњен и/или инактивиран пре него што заврши у коначном леку.

У савременој биотехнолошкој производњи (или биопроцесирању), обично постоје три или четири јединице операције у целој пречишћеној секвенци, способне да уклоне или инактивирају вирус. Ово укључује одређене хроматографске кораке (као што су протеин А или размена ањона), културу ниског пХ или детерџената и филтере за задржавање вируса. Неће сви ови кораци ефикасно уклонити или деактивирати све вирусе.

На пример, култура са ниским пХ је обично неефикасна за инактивацију вируса без омотача, али добро функционише за инактивацију вируса са омотачем. Под одређеним радним условима, колона за ањонску измену можда неће моћи да веже и уклони неутралне изоелектричне вирусе из тока производа, али је ефикасна против киселих вируса.

То је комбинација три до четири независне и ортогоналне јединице које заједно обезбеђују вирусну безбедност биотехнолошких производа.

Генерално се претпоставља да ће робустан, ефикасан и поуздан корак обраде моћи да уклони или деактивира велики број вируса (обично се дефинише као 4 лог10 или више, где се вредност смањења лог или ЛРВ израчунава као лог10 укупног броја вируса). број вируса на улазу подељен укупним бројем вируса на излазу). Међутим, ЛРВ се не може користити као јединствена апсолутна мера ефикасности корака. Подаци могу бити прелиминарни. Лако је за моделирање, релативно је неосетљив на промене у условима процеса и ефикасан против низа вируса (СЗО 2004).

Вирусна филтрација је широко призната као тако моћан и ефикасан корак у процесу и кључна је компонента укупне стратегије за минимизирање ризика од егзогених и ендогених вирусних честица током производње биотехнолошких производа.

Вирусни филтери често раде кроз јаке механизме задржавања засноване на величини. Засновано на овом моћном механизму деловања, вирусни филтери су вероватније него хроматографски кораци да обезбеде предвидљиво задржавање вируса за низ вируса. То је зато што је мање вероватно да ће филтер бити под утицајем разлика у физичко-хемијским својствима различитих вируса и интеракција вирус-смола регулисаних радним условима. Због тога се корак вирусне филтрације обично користи у добро осмишљеним рекомбинантним терапијским процесима пречишћавања протеина (ЕМЕА 1996), за које се такође показало да имају снажне перформансе у индустрији прераде плазме.

Међутим, производи од крви су као мач са две оштрице, који не само да спашава хиљаде живота, већ има и могућност ширења болести и угрожавања здравља људи. Према статистичким подацима, од 1977. до 1984. најмање 30000 прималаца крви у Сједињеним Државама примило је крв заражену вирусом АИДС-а. 1985. године, 1.200 од 3,000 хемофиличара у Француској, било је заражено АИДС-ом путем трансфузије крви или крвних производа.

Према подацима Светске здравствене организације, 5% до 10% инфекција АИДС-ом широм света узроковано је трансфузијама крви или крвних производа заражених АИДС-ом. Први случај АИДС-а у Кини заражен је употребом увезених крвних производа заражених вирусом сиде. Поред тога, забележен је и пренос болести хепатитиса Б и Ц услед трансфузије крви и крвних продуката.

1. Главни вируси који се преносе крвним производима и њихове карактеристике

Постоји много типова вируса који се преносе крвљу и крвним производима, као што је приказано у табели 1. Међу њима, ХИВ, ХБВ и ХЦВ су забринути у домаћим и страним медицинским круговима због њихове високе стопе инфекције и озбиљне штете.

Пошто крв и крвни производи имају могућност ширења вируса, то је озбиљно утицало на њену примену у превенцији и лечењу болести. Због тога се у производњи крвних производа морају додати процеси инактивације и уклањања вируса како би се осигурала безбедност крвних производа.

2. Главне методе инактивације и уклањања вируса

Да би се обезбедила безбедност крвних производа, поред одабира давалаца крви, имунизације где је то могуће, и стриктног тестирања прикупљене крви и других мера, инактивација и уклањање вирусног третмана крвних производа је важна карика за обезбеђивање безбедност трансфузије крви. Неколико често коришћених и ефикасних метода за инактивацију и уклањање вируса детаљно је описано у наставку.

Теоријска основа ове методе је да је брзина уништавања структуре вируса много већа од оне структуре протеина кроз избор температуре и времена деловања. Скоро 50 година резултата клиничке употребе и недавних експеримената на животињама потврдили су да албумин у раствору након 60 степени, 10 х топлотног третмана, односно Пастерове дезинфекције, може не само да инактивира ХБВ, већ и да инактивира ХЦВ и ХИВ, чинећи албумин најпоузданијим. крвни производ у вирусној безбедности.

Недавно је Пастеров процес проширен на производњу ИВИГ, ФВИ, ФИКС, фибриногена и других производа. Бридоннццу и др. је овај процес инактивације вируса додао ИВИГ процесу производње етанола на ниској температури, односно примењена је Пастерова метода у условима без стабилизатора, ниске соли и киселости, а титар вируса је смањен за 5 Лог. Симмондс ет ал. тестирао трансфузијом трансмитован вирус (ТТВ) концентрованих препарата ФВⅢ и ФИКС који се клинички користи у УК и открио да је стопа детекције ТТВ код производа без инактивације Пастеровог вируса била 50% до 75%, а стопа позитивне детекције производа након Пастерове инактивације био је 0.

Позитивна стопа на ТТВ била је 27% код 84 пацијента са хемофилијом у Уједињеном Краљевству који су користили неинактивиране производе фактора згрушавања, док је само 1 од 19 пацијената који су користили производе фактора згрушавања инактивираних вирусом био позитиван, са позитивном стопом детекције од 5%. Стога је процес инактивације вируса веома ефикасан у побољшању безбедности крвних производа.

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Велики број крвних продуката инактивираних С/Д методом се показао безбедним и поузданим кроз дуготрајну клиничку примену, па се широко користе. Међутим, ова метода нема способност инактивације против парвовируса Б19, ХЕВ-а и других вируса који нису обложени липо.

Инактивација сувом топлотом значи да се лиофилизовани препарат третира загревањем, а вирус убија сувом топлотом. Најчешће коришћене методе суве топлоте су 60 степени ~80 степени, 10~72 х метод загревања и 80 степени, 72 х третман. Још почетком 1980-их, било је корисно загревати лиофилизовани концентровани препарат ФВИИИ и протромбински комплекс на 60° ~ 80° током 10 ~ 72 х. Међутим, доказано је да ова метода не може у потпуности инактивирати ХБВ, ХЦВ, ХИВ. Третман сувом топлотом на 80 степени и 72 х показао се ефикасним у инактивацији ХБВ, ХЦВ и ХИВ-а. Такође је било недавних извештаја о лиофилизованим препаратима фактора коагулације третираних на 100 степени. Ксу Јинбо и сарадници су третирали ИгГ на 100 степени током 30 минута и инактивирали вирус везикуларног стоматитиса 8.2 Лог. Неки људи ће замрзнути сушени ФВИИИ на 68 степени током 72 сата, у сувом стању, а затим загревати на 100 степени 0,5 ~ 1 х. Овај метод је релативно економичан.

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Лог ћелија везаних за ХИВ, а тромбоцити су остали добри након 7 дана функционалног очувања ин витро, што је ФДА одобрила за клиничка испитивања.

Међу овим методама, Пастерова метода дезинфекције и С/Д метода су одобрене од стране ФДА Сједињених Држава и широко се користе у свету. Метода инактивације сувом топлотом је углавном погодна за вирусну инактивацију лиофилизованих препарата. Фотохемијска метода има снажан инактивациони ефекат на вирусе обложене липидима и коришћена је за инактивацију вируса целе плазме у Европи и има широке изгледе за инактивацију вируса у компонентама крвних зрнаца. Међутим, све ове методе имају своје недостатке, као што је Пастерова стерилизација није идеална за инактивацију неких вируса отпорних на топлоту; С/Д метода није могла ефикасно инактивирати вирус који није обложен липо. Фотохемијска метода је значајно оштетила активност неких протеина плазме. Тренутна клиничка употреба накнадних истраживања показује да ниједан метод инактивације вируса не може гарантовати да су крвни производи апсолутно ослобођени ризика од преношења вируса.

У производњи крвних производа, један процес инактивације не може инактивирати све вирусе; Поред тога, сам вирус је хетерологни протеин, као што је унос са производом изазвати нежељене реакције; Истовремено, због ограничености техничког нивоа, и даље постоје вируси чије карактеристике нису пронађене или схваћене, тако да постојеће методе инактивације вируса не могу гарантовати инактивациони ефекат ових вируса. Стога, сама инактивација не може гарантовати безбедност производа и мора се уклонити из производа. Дакле, технологија уклањања вируса добија све више пажње. Два најчешће коришћена и ефикасна процеса уклањања вируса су укратко описана у наставку.

Хроматографска технологија се односи на употребу различитих компоненти и разлика афинитета стационарне фазе или интеракције, како би се постигло раздвајање различитих компоненти. Као напредна технологија за производњу крвних производа, сама хроматографија има ефекат уклањања вируса, посебно афинитетну хроматографију и хроматографију измене јона. За хроматографију са изменом јона, елуција има предности у односу на пенетрацију у уклањању вируса. Табела 2 приказује статистику података о стопи уклањања ХАВ-а хроматографском технологијом у процесу производње албумина од стране компаније ЦСЛ у Аустралији. Као што се може видети из табеле 2, јоноизмењивачка хроматографија и гел филтрација су ефикаснији у уклањању ХАВ-а, са укупном брзином уклањања од 10,9 Лог.

У производњи ФВИИИ, Бактер Хеалтхеаре изводи имуноафинитетну хроматографију користећи гелове третиране анти-ФВИИИ антителима, који могу уклонити (4.2±0.1)Лог и (5.3±0.9)Лог из не -вируси обложени липидима као што су ППВ и ХАВ, респективно.

За неке вирусе са малим пречником површине, као што су ХАВ и парвовирус Б19, наномембранска филтрација је најефикаснији метод уклањања. Користи разлику у величини између протеина и вируса и адсорпцију вируса помоћу филтерске мембране да би изоловао вирусе. Лабораторијска студија је спроведена на локацији Санкуин Блоод Суппли Сите у Холандији о уклањању вируса додавањем једностепене, двостепене Планова 15Н наномембранске филтрације у процес производње протромбинског комплекса. Утврђено је да су стопе уклањања ХИВ, ХАВ и других вируса повећане у различитим степенима након наномембранске филтрације (видети табелу 3).

Међутим, могу се појавити следећи проблеми када се овај метод примењује у индустријској производњи: Прво, због високог вискозитета производа и присуства протеина великог пречника, величина пора мембране коју је изабрао филтер не би требало да буде премала, чиме се ограничава уклањање вируса малог пречника као што је ХЦВ; Друго, стабилност контроле величине поре на мембрани у процесу производње филтера ће утицати на уклањање вируса. Треће, када је отвор мембране мањи од пречника вирусне честице блокиран, брзина протока производа ће се смањити, што утиче на принос. Стога је избор мембрана чија својства и величина пора одговарају потребама прерађених производа важан фактор у томе да ли наномембранска филтрација може да уклони вирусе.

Под претпоставком обезбеђивања квалитета извора крви, процес инактивације и уклањања вируса је важно и неопходно средство за обезбеђивање безбедности крвних производа. Употреба само једног инактивираног вирусног процеса не може апсолутно гарантовати безбедност крвних производа. На основу технологије инактивације вируса, додата је технологија уклањања вируса као што су хроматографија и филтрација нанофилма, брзина уклањања вируса је значајно повећана, а ефекат инактивације и уклањања вируса је значајно побољшан. Тренутно је Европа јасно предложила да се у процесу производње крвних производа мора користити најмање једна инактивација и уклањање вируса како би се осигурала безбедност крвних производа.

У Кини већина произвођача крвних производа користи само један инактивирани вирусни процес у процесу производње, као што је Пастерова метода дезинфекције, С/Д метода итд., али не користи процес уклањања вируса, што озбиљно утиче на квалитет крвних производа. Уласком Кине у СТО, процес производње и стандарди квалитета домаћих крвних производа биће у складу са светским, иначе не може гарантовати постојећи удео на домаћем тржишту, али исто тако не може да се такмичи са сличним производима у другим земљама у региону. међународном тржишту.

Стога кинески произвођачи крвних производа морају побољшати производни процес, ојачати инактивацију и уклањање вируса, како би у потпуности осигурали квалитет и сигурност производа. Због тога ће кинески произвођачи крвних производа бити у тренду да користе хроматографију за пречишћавање крвних производа и уклањање вируса како би осигурали безбедност крвних производа.

Гуидлинг Тецхнологи је национално високотехнолошко предузеће које се фокусира на биофармацеутике, ћелијску културу, пречишћавање и концентрацију биомедицине, дијагностику и индустријске течности. Успешно смо развили центрифугалне филтерске уређаје, касете за ултрафилтрацију и микрофилтрацију, филтер за вирусе, ТФФ систем, дубински филтер, шупља влакна, итд. Који у потпуности испуњавају сценарије примене биофармацеутика, ћелијске културе и тако даље. Наше мембране и мембрански филтери се широко користе у концентрацији, екстракцији и одвајању предфилтрације, микрофилтрације, ултрафилтрације и нанофилтрације. Наше бројне линије производа, од малих, за једнократну употребу лабораторијске филтрације до производних система филтрације, тестирања стерилности, ферментације, ћелијске културе и још много тога, задовољавају потребе тестирања и производње. Гуидлинг Тецхнологи се радује сарадњи са вама!

Par: Механизам и контрола загађења ултрафилтрационе мембране

Sledeći: Хангзхоу Гуидлинг Тецхнологи ЦО., ЛТД дебитује у ЦПХИ Милану