Низводни процес концентрације ултрафилтрације/дијафилтрације: како ефикасно спречити продирање и губитак циљног протеина

Низводни процес концентрације ултрафилтрације/дијафилтрације: Како ефикасно спречити продирање и губитак циљног протеина

У низводним процесима пречишћавања рекомбинантних протеина, крвних производа и других биолошких препарата, ултрафилтрација/дијафилтрација (УФ/ДФ) се користи за концентрацију сировине, размену пуфера и уклањање соли и нечистоћа малих{0}}молекула. Раздвајање се постиже на основу мембранског просејавања: велики молекули као што су моноклонска антитела (мАбс) се задржавају у мембрани, док соли, ендотоксини, слободни протеини ћелије домаћина (ХЦП) и друге нечистоће малих-молекула пролазе кроз мембрану и уклањају се у пермеату. Током повећања{4}}процеса, губитак циљног протеина кроз мембрану може лако да дође, директно смањујући принос и повећавајући трошкове серије. У неким радним условима, протеин се може открити у пермеату, што захтева брзо одређивање да ли су исцуреле компоненте интактно циљно мАб, деградирани/фрагментирани агрегати или протеини ћелије домаћина. Овај чланак је подељен на два главна дела: разматра традиционалне приступе{7}}контроли процеса и, у комбинацији са дизајном експеримената (ДОЕ), успоставља робустан прозор процеса, подржан вишеструким аналитичким методама за одређивање идентитета протеина откривених у пермеату.

 

 

И. Кључни узроци продирања циљног протеина кроз мембрану током УФ/ДФ

1. Прекомерни трансмембрански притисак (ТМП)
Када је разлика у притиску на мембрани превисока, отпор растварача се повећава, терајући неки мономерни протеин у пермеат. Током повећања-навише, резервоар за напајање садржи већу запремину материјала и флуктуације притиска у цевоводу су израженије, што чини пролазни надпритисак вероватнијим него у лабораторијској скали.

2. Неправилан тангенцијални проток
Ако је брзина протока прениска, на површини мембране се формира -поларизациони слој густе концентрације, а локална концентрација протеина може премашити праг толеранције мембране. Ако је брзина протока превисока, напон смицања може изазвати структурно цепање мАб, стварајући мање фрагменте протеина који могу слободно да прођу кроз поре мембране.

3. Превише висока концентрација протеина у сировини
Када је концентрација протеина у храни превисока, протеин се акумулира на површини мембране и неки мономерни протеин се може пренети у пермеат. Ово је чест проблем у-продукцији великих размера.

4. пХ или проводљивост изван опсега процеса
Промене у карактеристикама наелектрисања протеина могу смањити његов радијус хидратације и привидну величину честица, што резултира абнормалном пермеацијом мембране.

5. Старење мембранске касете, висок дифузни флукс или недовољно претходно{1}}кондиционирање
Физички дефекти у мембранској касети могу директно да изазову цурење протеина и представљају ризик у вези са{0}}опремом. Поновљени ЦИП са јако алкалним растворима може постепено оштетити материјал полиетерсулфонске (ПЕС) мембране.

6. Прекомерна запремина дијафилтрације
Током продужене дијафилтрације, континуирано испирање растварачем може постепено да однесе мале количине мономерног протеина.

 

ИИ. Традиционалне практичне мере за спречавање продирања и губитка циљног протеина

(А) Контрола параметара процеса

1. Контрола трансмембранског притиска (ТМП)
Дефинишите горњу границу упозорења о притиску и успоставите аларме блокаде да бисте спречили пролазне утицаје високог{0}}притиска на слој мембране. Након одређивања основних параметара на малој скали, смањите безбедан радни притисак током-увећавања производње и резервишите одговарајући опсег толеранције процеса.

2. Оптимизујте попречни проток
Успоставите стабилан гранични слој и смањите поларизацију концентрације на површини мембране кроз унакрсно струјање, чиме се минимизира акумулација протеина на површини мембране на извору.

3. Ограничите коначну концентрацију након концентрације
Дефинишите границу концентрације на основу физичко-хемијских својстава протеина и избегавајте прекомерну концентрацију хране. За мАбс, рутинска коначна концентрација генерално не прелази 50 мг/мЛ; за нека мАб-склона агрегацији, концентрацију треба додатно смањити.

4. Контролишите пХ и проводљивост хране
Одржавајте стабилну величину хидратисаних честица протеина и избегавајте молекуларну контракцију изазвану поремећајима киселинске/базне или јонске{0}}снаге.

(Б) Опрема и оперативне контроле

1. Извршите испитивање интегритета мембранске касете пре сваке серије
Спроведите тест са{0}}тачком пре производње сваке серије да бисте идентификовали поломљена мембранска влакна. Оштећене мембранске касете треба одмах бацити да би се спречило континуирано цурење протеина.

2. Стандардизовати процедуру ЦИП чишћења
Контролишите концентрацију НаОХ и време контакта. Након јако алкалног чишћења, у потпуности уравнотежите материјал мембране да бисте смањили ризик од деформације пора мембране.

3. Користите степенасту дијафилтрацију
Користите размену пуфера-велике запремине током ране фазе да бисте уклонили соли и успорите проток дијафилтрације како се крајња тачка приближава да бисте смањили отпор и губитак протеина.

 

ИИИ. Успостављање простора за пројектовање процеса кроз ДОЕ (КбД карактеризација процеса; применљиво на ИНД подношење)

1. Факторски скрининг
Прегледајте пет кључних параметара процеса УФ/ДФ (П): трансмембрански притисак, брзина протока хране, почетна концентрација протеина, пХ вредности хране и радна температура.
Варијабле одговора: задржани принос, садржај протеина у пермеату, флукс у мембрани и проценат агрегата високе{0}}молекуларне{1}} масе.

Кроз анализу значаја, идентификујте кључне факторе који доприносе цурењу протеина.

2. Моделирање површине одзива
Изаберите четири параметра са највећим значајем да бисте конструисали површину одговора и анализирали интеракције између параметара. У многим радним условима, један параметар може остати унутар свог квалификованог опсега, док комбинација два параметра може довести до продирања протеина. Такви ефекти интеракције се не могу идентификовати традиционалним-факторима-по-по{{5} експериментима. На основу модела дефинишите оперативни простор за дизајн. Све док параметри процеса остају унутар овог опсега, ефективно задржавање протеина може бити осигурано док се нечистоће уклањају дијафилтрацијом.

3. Најгори-изазов (потребан за карактеризацију процеса)
Изаберите процесне параметре на крајњим границама рада да бисте симулирали варијабилност производње: максимални ТМП, минимални унакрсни проток и горња-гранична концентрација протеина. Уверите се да чак и под екстремним радним условима не дође до великог-губљења циљног протеина, чиме испуњавате захтеве ЦМЦ прегледа.

 

ИВ. Вишеструке аналитичке методе за идентификацију протеина откривених у пермеату и разликовање циљних мАб, деградационих фрагмената и ХЦП

На основу аналитичке ефикасности, трошкова и сценарија подношења прописа, методе се могу поделити у две категорије: брзи скрининг и потврдно тестирање. Брзим методама треба дати приоритет за рутинско праћење процеса; када се појаве абнормална одступања, треба користити прецизне методе идентификације.

1. УВ спектрофотометрија (брзи онлајн скрининг; пожељно за рутински надзор -пода у продавници)
Сакупите пермеат и измерите његову апсорпцију А280. Ово само може утврдити да ли је протеин присутан у пермеату и не може разликовати врсте протеина. Углавном се користи за рутинско праћење процеса. Континуирано повећање вредности А280 указује на погоршање цурења протеина и захтева хитну обуставу дијафилтрације и испитивање процеса.

2. СДС-ПАГЕ електрофореза (најчешће коришћена квалитативна метода идентификације)
Користите редукујућу и не{0}}редукујућу електрофорезу и упоредите позиције трака са онима циљног мАб у сировини:
1) Ако је позиција траке потпуно конзистентна са циљним мАб, нетакнуто мАб је прожело мембрану.
2) Ако се појаве траке ниже -молекуларне- масе, протеин је подвргнут хидролитичком цепању, стварајући фрагменте мАб.
3) Ако су траке разбацане са више различитих трака, већина су протеини ћелије домаћина (ХЦП) из Е. цоли/ЦХО ћелија домаћина, а не циљни производ.

3. Искључујућа хроматографија-величине{2}}високих перформанси (ХПСЕЦ)
Одвојите компоненте према величини молекула и упоредите њихова времена елуирања са онима на хроматограму сировине:
- Главни пик са истим временом задржавања као мАб указује на интактни циљни протеин.
- Раније елуирани максимум указује на агрегате/фрагменте велике{1}}молекуларне-тежине.
- Пик који се касније елуира указује на фрагменте деградације ниске{1}}молекуларне-тежине.
- Одсуство карактеристичног главног пика указује на протеине нечистоће ХЦП.
Овај метод може да обезбеди квантитативне податке и може бити укључен у извештаје о истраживању одступања процеса; високо је прихваћен у клиничким материјалима за подношење.

4. ЕЛИСА комплет за тестирање протеина ћелије домаћина-ХЦП
Ако се протеин открије у пермеату, резултат ЕЛИСА је повишен, а ХПСЕЦ не показује карактеристични пик мАб, може се у основи утврдити да је процурели материјал ЦХО протеини домаћина{0}}ћелија. Ово указује на непотпуно уклањање нечистоћа током пречишћавања узводно; нечистоће се испиру током УФ/ДФ фазе и не представљају губитак производа.

5. Верификација афинитетне хроматографије (протеин А хроматографија)
Протеин А специфично везује Фц регион мАбс. Убаците узорак пермеата на колону: појава карактеристичног пика елуције указује на присуство интактног циљног антитела; одсуство пика елуције показује да су сви протеини у пермеату протеини нечистоће.

6. Масена спектрометрија (ЛЦ-МС) (дубинска следљивост; користи се за истраживање великих одступања процеса)
ЛЦ-МС може директно да анализира секвенцу аминокиселина и тачно одреди порекло протеина. Углавном се користи за испитивање тешких или необичних одступања и не користи се као рутина у-тестовима контроле процеса.

В. Корективне радње које одговарају различитим аналитичким резултатима

1. Интактно циљно мАб детектовано у пермеату
Смањити трансмембрански притисак и коначну концентрацију након концентрације; сузити радни опсег процеса на основу резултата ДОЕ; и проверите интегритет мембранске касете.

2. Фрагменти деградације антитела откривени у пермеату
Истражите напон смицања током процеса и екстремне пХ вредности; оптимизовати корак узводне инактивације вируса да би се смањило цепање протеина.

3. Само протеини ХЦП нечистоће откривени у пермеату
Није потребно подешавање параметара УФ/ДФ. Пратите проблем до претходних корака хроматографије и побољшајте уклањање нечистоћа током хроматографије афинитета и јонске{1}}измене.

 

ВИ. Резиме

Да би се спречило цурење протеина током УФ/ДФ, традиционална контрола процеса се ослања на историјско искуство да би се дефинисали параметри појединачних тачака, који могу само на адекватан начин да се позабаве стабилном малом{0}}производњом. Да би се обезбедиле стабилне перформансе током постепеног повећања процеса-навише, карактеризација процеса заснована на ДОЕ-требало би да се користи за успостављање простора за пројектовање процеса са довољном толеранцијом. Контрола параметара заснована на интервалима може да компензује варијабилност производње. Једном када се протеин открије у пермеату, једноставан систем УВ детекције може да пружи почетно упозорење, након чега следи електрофореза, ХПСЕЦ и ЕЛИСА за следљивост и идентификацију. Ово омогућава прецизну диференцијацију између циљног производа и нечистоћа у ћелијама домаћина, омогућавајући циљано испитивање корена-узрока и корективне мере. Ово је такође стандардизована истраживачка компонента која је тренутно укључена у ЦМЦ документацију за пројекте мАб.