Како одабрати одговарајућу ултрафилтрациону цев
Ултрафилтрационе епрувете које се обично користе за концентрацију протеина и замену пуфера често се користе у ултрафилтрационим цевима. Постоје и други модели, који имају различите величине запремине и ултрафилтрационе цеви, у зависности од молекулске тежине циљног протеина, запремине пре концентрације и циљне запремине концентрације. За вишекратну употребу.
1. Изаберите одговарајућу ултрафилтрациону цев, углавном узимајући у обзир МВЦО и запремину концентрације. Генерално, молекулска тежина не би требало да буде већа од 1/3 молекулске тежине циљног протеина. Ако је молекулска тежина циљног протеина око 10 кд, може се користити ултрафилтрациона цев са задржаном молекулском тежином од 3 КД.
2. Новокупљена ултрафилтрација је сува. Додати млечну воду пре употребе. Вода потпуно пролази кроз мембрану и претходно се охлади у леденом купатилу или фрижидеру неколико минута. Затим сипајте воду да додате раствор протеина. Количина протеинског раствора не сме да прелази белу линију на врху епрувете. Лако руковање. Пре додавања протеинског раствора, ултрафилтрациона цев треба да се убаци у лед ради претходног хлађења.
3. Баланс. Маса и центар гравитације морају бити избалансирани. Имајте на уму да брзина и убрзање не би требало да буду пребрзи, иначе ће ултрафилтрациона мембрана бити директно оштећена. Започните центрифугалну ултрафилтрацију (претходно хлађење центрифуге на 4 степена). Смер мембране и ротирајуће осовине се могу подесити према упутствима (у случају угаоне центрифуге, дијафрагма је окомита на осовину). У стварној употреби, општа брзина је нижа од оне наведене у приручнику, што може продужити век трајања центрифугалне цеви.
4. када се концентрише до преосталих 1мл, [узмите 50ул раствора Брадфорда за домаћинство, додајте 10ул течности да видите да ли постаје плаво, и утврдите да ли ултрафилтрациона цев пропушта протеин. Ако епрувета цури, сипајте је у горњи слој, а затим вратите у нову епрувету да бисте започели ултрафилтрацију. Да бисте тачно утврдили да ли епрувета цури, 5мг 10мин центрифугирајте 10мин, а затим прођите кроз њу, прођите протеински гел или Брадфорд] [грубо мерење]. Наставите да додајете преостали раствор протеина да се концентрује (радите на леду да бисте спречили загревање протеина) док се не додају сви концентровани раствори. Током центрифугирања обратите пажњу на то да ли долази до таложења протеина и изазива блокаду епрувете. Ако дође до падавина, молимо вас да одредите специфичан узрок падавина, да ли је концентрација протеина превисока или је пуфер неодговарајући; Први се може решити коришћењем више ултрафилтрационих епрувета у исто време да би се смањила концентрација, док други могу променити различите пуфере док се протеин не исталожи.
5. Претходни кораци се користе за концентрисање протеина. Ако треба заменити пуфер, када се укупни раствор протеина концентрише на око 1мл, нежно додајте нови пуфер (ултрафилтрација кроз 0.22ум ултрафилтрациону мембрану), а затим континуирано концентрујте до око 1мл три пута, тако да да коначна концентрација зависи од потребне концентрације протеина, која обично није већа од 500ул или мања од 200ул. Према запреминској концентрацији од најмање 10 пута сваки пут, то је више од 1000 пута више од три пута, што у основи може постићи сврху промене пуфера.
6. Уклоните коначни концентрат протеина. Оперите на леду. Користећи жути врх пипете (200ул), нежно уметните врх пипете дуж ивице, затим нежно удувајте и помешајте протеински раствор. Пазите да не додирнете ултрафилтрациону мембрану. Сваки пут усисати концентровани раствор до 200ул док се потпуно не усисава. Није потребно екстраховати последњи концентровани раствор на дну епрувете, иначе је сувише тешко и може доћи до оштећења ултрафилтрационе мембране. Коначно, миллик вода се додаје у ултрафилтрациону цев без проласка кроз ултрафилтрациону мембрану да би се спречио губитак воде и сушење мембране.
7. Следе кораци за обраду ултрафилтрационе цеви и поновну употребу ултрафилтрационе цеви.
8. Сипајте воду у цев за ултрафилтрацију и нежно исперите миллик водом неколико пута. [ако постоји очигледно таложење протеина на дну епрувете, можете прво додати воду, а затим је испухати пипетом. Пазите да не додирнете мембрану. Талог виси, а затим бежи. Не можете га испрати водом из чесме. Након додавања 0.2 м раствора НаОХ, ставите га на собну температуру на 20 минута и балансирајте епрувету за ултрафилтрацију током тог периода. Центрифугирајте још 10 минута. Излијте преостали раствор НаОХ и потопите језгро од памука у чашу (1 или 2Л) Миллик воде, стављену на неколико сати, а затим замењену новом водом, стављену на неколико сати да се континуирано разблажи концентрација НаОХ. Оперите епрувету од 50 мл и покријте водом из славине, а унутрашњи зид оперите млаком водом.
9. Извадите језгро уроњене епрувете, додајте га у пуну миллик воду, а затим напуните епрувету од 50 мл миллик водом. Полако ставите језгро епрувете у 50 мл.
Центрифугирајте епрувету, оцедите и поделите воду, затим поклопите и чувајте на 4 степена до следеће употребе. Уопштено говорећи, према горе наведеним корацима и мерама опреза, свака епрувета се неће сломити у року од три или четири године.