Потпуна анализа процеса производње МРНА лекова: Како ТФФ технологија решава изазове пречишћавања
Последњих година, мРНА технологија је постигла значајан напредак у биофармацеутској области, показујући огроман потенцијал примене, посебно у вакцинама и генској терапији. Успешан развој мРНА вакцина не само да је обезбедио нова решења за превенцију и контролу заразних болести, већ је такође покренуо напредак у имунотерапији рака и персонализованој медицини. Као нова класа терапеутских производа, производња мРНК великих-размјера представља велики изазов, укључујући контролу стабилности РНК, уклањање резидуалних ензима и реакцијских производа-производа, размјену пуфера и постизање високих-стопа опоравка чистоће, а све то захтијева производне технологије са регулаторним- решењима.
Процес производње мРНК вакцина или терапеутика углавном је подељен у три фазе: припрема плазмидне ДНК раствора у маси, припрема мРНА масовног раствора и припрема мРНА-ЛНП лека.
Дијаграм тока процеса производње мРНА лекова
Филтрација тангенцијалног протока (ТФФ), као добро{0}}уходана технологија мембранског одвајања, широко се примењује у производњи мРНК због своје високо{1}}способности молекуларног просејавања, размене пуфера који се може контролисати и ниских карактеристика смичног напона. Засновано на дизајну мембранског модула, уобичајене ТФФ конфигурације укључују равне-касете са листовима и модуле са шупљим{4}}влакнима. Поред тога, мембранско одвајање - под притиском у ТФФ-у може се класификовати на микрофилтрацију (МФ), ултрафилтрацију (УФ), нанофилтрацију (НФ) и реверзну осмозу (РО) према величини пора мембране, са прогресивно растућом селективношћу.
ТФФ игра кључну улогу у више фаза производње мРНК лекова, укључујући припрему плазмидне ДНК, масовну производњу мРНК и коначну формулацију мРНА-ЛНП лекова. Одговарајућим одабиром типа мембране, пресека молекулске масе-(МВЦО) и материјала мембране, ТФФ омогућава ефикасно уклањање реакционих нуспроизвода и нечистоћа ниске-молекуларне-тешке, док такође олакшава размену пуфера и концентрацију пре и после инкапсулације ЛНП. Ово значајно побољшава чистоћу РНК, стабилност и укупну скалабилност процеса.
Поред тога, на перформансе филтрације тангенцијалног протока утичу фактори конфигурације система као што су тип пумпе и дизајн цеви, као и кључни параметри процеса укључујући трансмембрански притисак (ТМП), напон смицања и флукс филтрације. Ови фактори морају бити пажљиво одабрани и оптимизовани на основу карактеристика циљног производа, посебно за производе{1}}осетљиве на стрес као што је мРНА–ЛНП, који су веома подложни спољним механичким силама током обраде.
Пречишћавање плазмидне ДНК
Припрема основног раствора плазмидне ДНК је у основи заснована на дизајну секвенце шаблона за транскрипцију. Методе припреме обично укључују амплификацију плазмидне ДНК, мада се такође може користити и ПЦР амплификација. Узимајући за пример амплификацију ДНК, пројектовануЕ. цолисе обично користи за ферментацију{0}}базирану амплификација. Низводни процес пречишћавања углавном укључује сакупљање ћелија, лизу и бистрење, концентрацију и размену пуфера, стерилну филтрацију, линеаризацију и хроматографско пречишћавање. У индустријским окружењима, центрифугирање са континуалним протоком-често се користи за сакупљање ћелија, али генерише релативно велике силе смицања. Системи шупљих влакана, са својим отвореним каналима и малим смицањем, погоднији су за руковање узорцима са високим садржајем чврсте материје, високим вискозитетом или осетљивошћу на смицање, као што је плазмидна ДНК. Након сакупљања, ћелије се подвргавају хомогенизацији високог{6}}притиска, ултразвучној или алкалној лизи, након чега следи прелиминарно бистрење кроз дубинску филтрацију.
Да би се олакшала накнадна хроматографија, често се прво користи филтрација тангенцијалног протока (ТФФ) помоћу мембранских касета или колона са шупљим влакнима са пресеком молекулске масе-од 30 кДа, 100 кДа или 300 кДа за концентрацију и размену пуфера. Ово смањује запремину узорка док се истовремено уклањају неке нечистоће као што су РНК, протеини ћелије домаћина (ХЦП) и ДНК фрагменти ћелије домаћина (ХЦД). Хроматографија служи као основни корак пречишћавања. Типично, хроматографија измене ањона (АЕКС) се комбинује са хроматографијом хидрофобне интеракције (ХИЦ) да би се ефикасно уклониле нечистоће и обогатила високо биоактивна суперсмотана плазмидна ДНК, чиме се значајно побољшава чистоћа плазмида.
Након пречишћавања, плазмид се поново подвргава ТФФ-у да би се раствор концентрисао до циљне концентрације (обично 0,5-2 мг/мЛ) и да би се извршила дијализа са коначним пуфером за складиштење. Овај корак уклања заостале соли и органске раствараче из процеса, обезбеђујући да пуферски систем испуњава захтеве за низводне реакције ин витро транскрипције (ИВТ).
Пречишћавање ин витро транскрибоване (ИВТ) мРНА
Ин витро транскрипција (ИВТ) и модификација су кључни процеси за припрему основних раствора мРНК. Током производње ИВТ мРНА, користи се комбинација филтрације тангенцијалног протока (ТФФ1) – хроматографије – филтрације тангенцијалног протока (ТФФ2). Ова стратегија обезбеђује ефикасно и{4}}квалитетно пречишћавање иРНК, пружајући кључну подршку за производњу вакцина.
Након што се заврше реакције транскрипције и модификације, обично се прво изводи ултрафилтрација/дијафилтрација помоћу мембранских касета или колона са шупљим влакнима са пресеком молекулске масе-од 30 кДа, 100 кДа или 300 кДа. Овај корак ефикасно уклања различите нечистоће у вези са процесом-из реакционог система, као што су РНК полимераза, заостали ДНК фрагменти, неизреаговани НТП, ензими за затварање, дволанчана РНК (дсРНА) и инхибитори малих -молекула, док се истовремено постиже размена пуфера. Након једног корака филтрације тангенцијалног тока, већина нечистоћа се ефикасно уклања, а једина детектабилна заостала протеинска нечистоћа је РНК полимераза.
Затим се примењују вишеструке хроматографске технике за даље пречишћавање. Најчешће коришћене методе укључују афинитетну хроматографију, хроматографију{1}}искључивања величине, хроматографију са јонским паром са реверзном-фазом и хроматографију са изменом јона. Кроз ову комбинацију ултрафилтрације и секвенцијалне хроматографије, мРНА постиже висок ниво чистоће.
Да би се испунили захтеви за формулацију или складиштење, основни раствор мРНА се поново концентрише или разблажи коришћењем 30 кДа, 100 кДа или 300 кДа мембранских касета или колона са шупљим влакнима да би се прецизно подесила циљна концентрација и размена у пуферу финалне формулације. На крају, примењује се стерилна-филтрација за контролу микробног оптерећења, чиме се завршава привремено складиштење и пуњење материјала.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 ЛМХ).
Пречишћавање мРНА-ЛНП формулација
Липидне наночестице (ЛНП) су тренутно најопсежније проучавани систем за испоруку мРНА терапеутика. Тренутно су различите формулације мРНА-ЛНП у различитим фазама претклиничког и клиничког развоја. ЛНП-ови су веома осетљиви на производне процесе. Међу операцијама јединица које су потребне за производњу мРНА-ЛНП, концентрација и размена пуфера путем филтрације тангенцијалног протока (ТФФ), као и стерилна филтрација представљају значајне изазове. Ови кораци морају бити пажљиво оптимизовани да би се обезбедила скалабилност процеса и квалитет производа, уз избегавање проблема као што су онечишћење мембране и неправилно пуњење филтера.
Након инкапсулације мРНА, за пречишћавање се користи филтрација тангенцијалног протока (ТФФ). Сврха овог корака је уклањање некапсулиране мРНК, слободних полимера или липидних материјала, као и заосталих растварача из мРНК и липида. Пошто мРНА-ЛНП-ови показују ограничену стабилност на собној температури, оптимизација низводних процеса, укључујући ТФФ, је кључна за одржавање квалитета производа.
Кључни правци оптимизације укључују: одговарајуће подешавање трансмембранског притиска (ТМП) и тангенцијалне брзине протока на основу величине честица и стабилности мРНК-ЛНП-а како би се уравнотежила ефикасност филтрације и стрес честица; бирање мембрана или колона од шупљих влакана са одговарајућим ограничењима молекулске тежине (МВЦО, нпр. 100 кДа или 300 кДа) да би се ефикасно уклонила слободна мРНА, нечистоће и пуфер за размену док се минимизира адсорпција или оштећење честица; и оптимизовање запремине концентрације и дијафилтрације да би се обезбедила ефикасна размена пуфера у циљној формулацији и контролисала коначна концентрација и дисперзност честица.
Поред тога, критични атрибути квалитета (као што су величина честица, индекс полидисперзности [ПДИ] и ефикасност инкапсулације мРНА) морају бити пажљиво праћени током процеса, а параметри се динамички прилагођавају на основу података у реалном-временском времену како би се постигло стабилно, скалабилно и ефикасно пречишћавање и формулација мРНК-ЛНП-а.
Поред тога, због нестабилности мРНК-ЛНП-ова и њихових компоненти под терминалним методама стерилизације, 0,2 µм стерилни-филтер се обично користи за уклањање бактерија и других микробних контаминаната.