Резиме:

Овај чланак прегледава два кључна фактора који се морају размотрити у стратегијама пречишћавања протеина: захтеви за пријаву низводно и биолошке карактеристике самих протеина. Чланак наглашава да је висококвалитетно пречишћавање протеина основа за поузданост и поновљивост експерименталних података, посебно за производњу рекомбинантних протеина. Различити сценарији апликације имају посебне захтеве за чистоће протеина, активности активности или ендотоксина, а карактеристике протеина могу значајно утицати на стратегије за прочишћавање. Према специфичним случајевима, чланак илуструје да јединствени протеини треба да усвоје прилагођене шеме пречишћавања. На крају је предложени систематски процес производње протеина (Слика 1), наглашавајући контролу квалитета квалитета из одабира експресијских система, грађевинским дизајном до оптимизације пречишћавања и препоручивање процене протеинских хомогености и функционалности кроз биофизичке технике (као што је СЕЦ-МАЛС, ДСФ итд.). Овај чланак има за циљ да пружи практичне смернице за истраживаче, помажући им да формулишу ефикасне и поновљиве стратегије пречишћавања на основу карактеристика и захтева за примену циљних протеина, чиме побољшавају квалитет и ефикасност научних истраживања.

 

Слика 1. Схематски дијаграм процеса производње протеина

 

Производња протеина високе потражње - примери идентификације проблема, Дизајн стратегије ублажавања и одговарајућег излаза

 

1.нуклична киселина везивање за протеин:

Приликом прочишћавања протеина који веже нуклеинске киселине, потребно је више корака за уклањање контаминације нуклеинских киселина. Током лизе морају се додати нуклеа опште (попут СМ-а нуклеазе (бензонасе®) или дназа или РНасе), али везане нуклеинске киселине не могу се у потпуности уклонити. Замените кораке за уклањање нуклеинских киселина, као што су падавине за сулфат ПЕИ или Стрептомицин, хепаринско пречишћавање или хроматографија за размену јона. Присуство нуклеинских киселина је надгледало односом А26 0 НМ / А28 0 нм током процеса пречишћавања. Ако је омјер нижи од 0,6, назначио је да је чистоћа протеине била релативно висока, а контаминација нуклеинске киселине је била минимална. За протеине са снажно везаним нуклеинским киселинама могу се привремено дератили (као што је третирано урејом), а затим поново постављен. Кључне тачке: Користите висококвалитетне реагенсе, свеже пуфере и чисте ступце (чистите са 0,5м НаОХ пре употребе).

 

2 Миш Ферритин Хеави Цхаин:

Сврха израде прочишћеног миша феритин хеави ланца (МФТ1) протеина је висока резолуција крио-електронска микроскопија (Црио-Ем). Есцхерицхиа цоли експресијски вектор кодирала је неоснована МФТХ1 ултразвучно поремећена без додавања било каквог нуклеаза. Након грејања у 7 0 степени, подвргнут је количини амонијум-сулфата, дијализи и хроматографије у искључивању величине. Добијени узорак показао је присуство велике количине контаминаната у Црио-Елецтрон микроскопијским сликама (слика 2а), која је била потпуно неприкладна за њену примену. Оптимизирајте кораке. Додајте СМ нуклеасе током процеса лизе ћелије и процеса дијализе након падавина амонијум сулфата, а затим додајте корак хроматографије анионске размене да бисте смањили омјер А26 0 НМ / А280НМ од 1,4 до 0,8. После величине Хроматографија искључења, однос А260НМ / А280НМ коначног узорка МФТХ1 био је 0,56. СДС-Паге и Црио-Елецтрон микроскопијске слике (слика 2б) показала су да је протеин био веома чист, што указује да су контаминанти били ефективно уклоњени.

Слика 2 муша феритин тешког ланца

 

 

 

3. Химерни протеин Хуман ДСРБЕЦ (ДСРБД-ЕГФ-ЦХИМЕРА):

ДСРБЕЦ се формира Фусион двоструко насуканог РНА везивног домена (ДСРБД) хуманог протеина киназе и фактора раста људског епидермалног раста (ХЕГФ). Када је ДСРБД изражен у Есцхерицхиа Цоли, показује изузетно високу способност везивања ДСРНА. Након лизе ћелије, контаминантна РНА ће ометати везивање рекомбинантних протеина у колумну фиксне металне ионске афинитетне афинитет (ИМАЦ). Конвенционалне методе попут ПЕИ или Стрептомицин сулфата сулфата, третман РНасе или решења са високим соли не могу уклонити РНА. Лиза ћелије је извршена коришћењем пуфера који садржи 4М урее. Супернатант је учитан на ИМАЦ колону и 4м до 0 м уреа је полако користио преко ноћи (Ренатурација колоне). Пуфер за ренатуацију је додат са имидазолом и елуиран из ИМАЦ колоне. Коначно прецизирање је извршено преко СуперДек 75 гел филтрације да би се добио функционално активан ДСРБЕЦ.

 

4. Протеини везани за дивалентне катионе или друге кофактере:

За протеине који комуницирају са дивалентним катицијама као што су Зн 2+, Цу 2+ или други кофактори, то је пресудно за додати одређене дивилентне катионе (или друге кофакторе) током изражавања. Током процеса пречишћавања потребно је и мала количина истих дивиштантних катиона (или других кофактора). Међутим, употреба било којих хелантних средстава (као што је ЕДТА, ЕГТА) и хелациона средства за смањење (као што је ДТТ или ДТЕ). Када се баве протеинима везаним за дивилентне катионе, мешавина инхибитора протеазе не мора се користити за потврђивање стварног присуства дипломираних катиона (или других кофактора) у пречишћеном протеину кроз спектроскопске методе (као што је спектроскопски спектрофотометрија).

 

5. Рекомбинантни феридоксин (РФД) који садржи један [2ФЕ ± 2С] кластер из термофилне цијанобактерије мастигокладус ламиносус

Ферридоксин је растворљив протеин за гвожђе-сумпор који учествује у реакцијама електрона. Постројење типа ФЕРРОРЕДОКСИН носи једно [2ФЕ ± 2С] кластер као електронски актер-омотач фотосаметача И. Есцхерицхиа цоли БЛ21 (ДЕ3) сој изразио је рекомбинантни РФД протеин у ТБ медијуму који садржи 10 мм ФЕЦЛ3 и антибиотике. Елуција колумне за хватање ИМАЦ-а изведена је коришћењем пуфера који садржи 10 мм хистидин да би се избегло имидазол и спречило уништавање кластера [2ФЕ ± 2С]. Анионска размјена и величина хроматографија искључења коришћена је за даљње пречишћавање и концентрацију на 12 мг / мл за скрининг кристализације. У поређењу са рекомбинантном производњом ферорерорексина, природни ферорерорексин пречишћен из плаво-зелених алги мастигокладус ламиносус постигао је већу резолуцију током кристализације.

 

6 Протеини који се користе као антигени

Протеини се често користе као антигени за опоравак циљаних лиганда. Прво је размотрити је да ли се протеина користи за ин виво имунитет за добијање конвенционалног моноклонског или поликлоналног ИгГ-а или за програме који укључују камилу ИгГ или у процесима одабира витроа.

 

6.1 Антигени који се користе за рутинску производњу антитела

Када се антигени користе за производњу моноклоналних ИгГ антитела, обично није потребно, јер већина моноклонских антитела препознаје линеарне епитопе које нису увелико под утицајем структуре антигена, па чак и денатурисани антигени (попут инклузивних протеина тела), а чак и денатурисани антигени (попут инклузијских телесних протеина) остају ефикасни. Међутим, чистоћа се мора строго контролисати како би се избегло снажно имуногено контаминант који ометају имуни одговор и изазива доминацију нефарних антитела.

 

6.2 Скринин коњугатне библиотеке

Посебну пажњу треба посветити одржавању природне конформације антигена током прераде библиотеке Нанободи добијене имунизацијом камиле. За разлику од конвенционалних антитела, девајски антитела (посебно нанободији) имају тенденцију да препознају структурне епитопе, које је повезано са њиховом јединственом конвексном структуром комплементарног места. Слично томе, приликом пројекције великих синтетичких или природних библиотека антитела ин витро, антиген мора да води структуру која је у потпуности у складу са циљаном апликацијом. Пошто сам процес сцреенинг не пристрасан, ако антиген има погрешно разматрање, агрегацију или конформациону хетерогеност, велики број коњугата који циљају не-природне епитопе може се приказати.

 

 

 

7. Протеини који садрже интермолекуларне или интрамолекуларне дисулфидне обвезнице или бесплатни цистеин

Дисулфидне обвезнице су пресудне за стабилизацију природне структуре протеина. Током процеса пречишћавања, приликом пречишћавања протеина који садрже интермолекуларне или интрамолекуларне дисулфидне обвезнице, потребно је да се избегне додавање смањења средстава за спречавање конформационих промена протеина, чиме се мењају тако да мењају њихове функције. За протеине који садрже слободни цистеин, смањење средстава су неопходно у свим корацима процеса пречишћавања, посебно током складиштења, како би се спречило формирање вештачких дисулфидних обвезница. Најчешће коришћена средства за смањење су ДитхиотхРеитол (ДТТ), меркаптоетанол (-ме) и Трис ({2}} карбоксиетил) фосфин хидрохлорид (ТЦЕП). За иМац смоле које су неспојиве са ДТТ-ом или ТЦЕП-ом, препоручује се употреба -Ме и заменити их другим редукцијским средствима у наредним корацима.

 

8. Фрагмент рекомбинантног антитела

Иако је структура фрагмената рекомбинантних антитела (попут нанободија) једноставнија од оне ИгГ, њихова функција зависи од исправне формације дисулфидних обвезница. У системима бактеријске експресије, чак и са усвајањем стратегија оптимизације, могу се и даље појавити заглављене или делимично пресавијене производе, који постоје и у растворљивом делу и у организовању у организовању. Више прикривено је да чак и правилно пресавијени фрагменти антитела могу формирати растворљиве агрегате (колоидни агрегацију) кроз хидрофобне плакете на површини. Такве агрегате је тешко идентификовати у рутинским функционалним тестовима (као што је ЕЛИСА), јер мултивалентно везивање може да маскира пад мономера афинитета, али њихово присуство може озбиљно утицати на апликације које се ослањају на малу величину молекула (као што је микроскопија супер резолуције). Због тога се ослањају искључиво на СДС-Паге је недовољно за процену квалитета узорка. Биофизичке методе као што је филтрација гела (слика 3) морају се усвојити за разликовање мономера (главне врхове) од агрегата (врхови запремине искључења). Кључне контролне тачке укључују: оптимизујући редовни околиш током изражавања да би се промовисали стварање дисулфидних обвезница и оптимизацију услова за складиштење након пречишћавања како би се спречило агрегацију. Ове мере су пресудне за осигурање монодисперита и функције фрагмената антитела.

Слика 3. Гел филтрација Одвајање растворљивих агрегата нанободија

 

9. Растворљиви фрагменти лимфоцитног рецептора ЛЛТ1

Рекомбинантни израз протеина зависних од дисулфида (као што су лимфоцитни рецептор ЛЛТ1) често се суочава са преклопним потешкоћама. Гел Филтрација дивљег типа ЛЛТ1 показала је врхове агрегације и димерним врховима (слика 4а), али масовна спектрометрија открила је загревање узроковано непарисаним цистеином у димери (слика 4б). У ту сврху су дизајниране две мутанте: један је уклонио проблем цистеин, што је резултирало нагли пад приноса (слика 4а); Након увођења неоцистеина да реконструише усаглашену дисулфидну везу, мутант није имао само висок принос и добру стабилност, али такође може кристализирати (слика 4ц), а 3Д структура је потврдила да је мутант формирао тачну дисулфидну везу и задржао природно преклапање. Овај случај показује да рационално дизајнирањем конформалних дисулфидних обвезница, у комбинацији са анализом филтрације гела и масовне спектрометрије, склопиви проблем рекомбинантних протеина може се ефикасно решити, а могу се добити функционални протеини са стабилним структурама и високим приносима.

Слика 4. Реконструкција дисулфида Бонда побољшава преклапање и принос растворљивог ЛЛТ1

 

 

 

10. Лако агрегални протеини

Прочишћавање рекомбинантних протеина често се суочава са проблемом агрегације, а његова формација прати механизам "раста на нуклепорт-расту - мала количина растворљивих агрегата формира се прво, а затим покреће велики нерастворљиви агрегацију великог разводног веродостојности. Да би се позабавило овом изазову, потребно је усвојити стратегије више нивоа: на фази изразе, то се може постићи оптимизацијом оптимизације температуре културе, користећи модификоване културне медије или различито растворивање система за пречишћавање (инсецт / сисари), и замена експресионске животне средине (у шифрификационом концентрацији (у шифрификацијском концентрацији) и "у износу од 4 степени. Као директна веза за ИМАЦ до СЕЦ-а) треба усвојити да се одмах уклоне збирно језгра. Генерално гледано, када треба узети у обзир у размјери прегледе пуфера, фактори попут састава компонената, пХ вредност, дисоцијално средство или солубилизатор (слика 5). Кроз фину оптимизацију ортогоналног детекције (као што је сек, ЦД, ЛС, ДСФ и температурни помак на основу топлоте флуоресценције итд.), Квалитет протеина утврђено је и најприкладније раствор пуфера.

Слика 5. Стратегије за ублажавање агрегације протеина

 

11. Кристализација хумане КЛК1 киназе (како добити репродуктивне серије)

Да би се добила хомогена не-фосфорилацирана КИНК1 киназа за студије кристализације, усвојена је више-стратешка колаборативна шема. Прво, био је изражен λ -фосфатазом у Есцхерицхиа Цоли да би се елиминисала хетерогеност аутофосфорилације. Иако је принос смањен, обезбеђена је комплетна дефосфорилација. Након урођивања од стране ИМаца, елуент је допуњен стабилизаторима (50 мм аргинина, 50 мм глутамичка киселина и 10 мм ДТТ) како би се спречило агрегација, концентрисана, а његова ознака је уклоњена ТЕВ ДИРЕСТИОН. Затим је исправан олигомер раздвојен за сец (који садржи 5% глицерола и -ме). Коначни кључни размјенски корак размјена аниона разликује се између кристалног (не-фосфорилацираног) и не-кристалног (делимично фосфорилационих) ЦЛК1 група. Посебно је вредно напоменути да начин лизе ћелије значајно утиче на стабилност протеина - метода високог притиска и високих температура доводи до неповратног агрегације ЦЛК1, истичући значај благе третмане за припрему киназе.

 

 

 

12. Производите галектин -1 са стабилном способностима везивања лиганда

Припрема функционалног галектина -1 за лигандске студије обавезујуће, израз и стратегије пречишћавања четири конструкције (необележени и његов налепљени галектин дивљег типа -1, неоснован и његов цистеински галектин без цистеине {-1). Кључни налази указују на то да је пречишћавање хроматографије афинитета лактозе може ефикасно екран за правилно склопљени протеини, али треба да се комбинује са темељним дијализом (хепес пуфером) да у потпуности уклони лактозу са везујућег места и обнавља активност ЦРД-а. Галектин дивљег типа -1 је склон оксидацији и инактивацији, а његова стабилност остаје ограничена чак и у присуству смањења средстава (Слика 6). Међутим, мутант без цистеина значајно повећава дугорочну стабилност уз одржавање упоредиве активности аглутинације и топлотне стабилности (верификовано од стране НаноДСФ, ИТЦ итд.) Елиминисањем зависности од расуалфида.

Слика 6. Хидродинамичка карактеризација рекомбинантног галектина -1 открива његову нестабилност

 

13. Уклањање ендотоксина

Метода уклањања ендотоксина заснива се на хроматографији афинитета, укључујући позитивно напуњену хроматографију (Анион Екцханге), употреба полификацијаних лиганда (као што је поли-Л-лизин (ПЛЛ), имобилизовани полиамин (Полимикин Б), и додавање површински активирања Тритон Кс -114. Током процеса пречишћавања обратите пажњу на припрему пуфера са водом без ЛП-а и користите нове ступце или ступце које су се користили само у другим пречишћавањем без ЛПС-а. За контаминацију ендотоксина, хроматографски систем пумпе / течности може се инкубирати преко ноћи у 0. 5м НаОХ или 4 сата у 1. 0 М НаОХ. Коначна количина ЛПС у узорку је процењена коришћењем Лималус Амебоците Лисате Реагенс (ЛАЛ) и верификована је да ли је била испод границе потребне за одређену примену.

 

14. протеинска комплекса

Израз и пречишћавање протеинских комплекса морају бити оптимизовани у складу са специфичним условима. Изазови укључују нестабилност или загревање подјединица. Свака подјединица може се изразити независно и састављена ин витро или се изражава да формира функционални протеинске комплексе. Грађевински дизајн треба пажљиво увести са налепницама за пречишћавање или откривање да не ометају Скупштину, посебно када су сложене информације ограничене и потребно је више оптимизација. Током процеса пречишћавања потребно је проценити интегритет и стабилност комплекса. Методе укључују страницу СДС-а (субњенит детекција), СЕЦ (хомогеност), сеЦ-МЛС (моларна анализа масе), масовна фотометрија или природна масена спектрометрија (масовна маса). Треба напоменути да се комплекс може дисоцирати у ниским концентрацијама. У то време, хроматографска метода или пуфер (као што су кроз термичке дрифт или ДСФ пројекције) треба оптимизовати. Поред тога, смањење корака пречишћавања може спречити губитак слабих међународних подјединица и уравнотежити ефикасност пречишћавања и интегритет комплекса.

 

 

 

15. Пречишћавање комплекса антигенских антитела

Комплекси антитела-антигена су типични примери протеинских комплекса. Њихова ко-кристализација може открити обрасце везивања и водити оптимизацију инжењерског антитела. Традиционалне методе захтевају одвојено пречишћавање антигена и антитела, а затим их мешање. Међутим, недавне студије су показале да су стратегије ко-прочишћавања и стратегије ко-пречишћавања су ефикаснија. Потребна је само једно пречишћење за добијање комплекса, а истовремено се нестабилни антигени могу стабилизовати кроз антитела, па чак и да се може постићи и брз на етикету. У овој конкретној ситуацији, СДС-Паге и ГЕЛ филтрација (сец) су обично довољне да процене чистоће и квалитет комплекса.

 

Резиме

Прочишћавање протеина је основна технологија у научним истраживањима. Производња академског протеина обично следи стандардне стратегије и може произвести високу чистоћу Миллиграм, растворљиве протеине, који се широко користе у структурној биологији, биохемији и функционалним истраживањима. Међутим, посебне захтеве низводне апликације (попут потребе за експериментима на животињама и немамо загађење нуклеинских киселина) или својствене карактеристике протеина (као што је једноставна агрегација, која садржи дисулфидне обвезнице или високу афинитет нуклеинске киселине) често захтевају прилагођена решења. Овај преглед, као одговор на ове посебне околности, предлаже рафиниране стратегије у распону од избора система експресије, дизајном конструкција (оптимизирајући налепнице и границе домена) у процес пречишћавања и уводи контролу квалитета (као што је Сец, СДС-Паге, детекцију активности.) На кључним корацима. Неке апликације такође захтевају додатну анализу (као што су одлучност за откривање ендотоксина и остатака нуклеинске киселине), слично концепту "осигурања квалитета" (КА) у биофармацеутској индустрији, односно да се спречи оштећења систематским процесима. Формулирањем смерница за контролу квалитета и разјашњење специфичних стандарда за протеинске реагенсе који се користе у научном истраживању, циљ је успостављање ригорозних норми прочишћавања протеина за академске лабораторије, побољшавају поузданост и поновљивост експерименталних података и премостили су јаз између основних истраживачких и индустријских стандарда.

 

Дои: 10.1186 / с 12934-022-01778-5