Литература Схаре|Збогом сложено пречишћавање? Новов ТФФ + метода површински активна средства побољшава ефикасност и смањује трошкове у ААВ векторској производњи

Генска терапија се брзо развија, али његова висока цена остаје велика препрека спречавајући шири приступ пацијентима. Међу кључним возачима ове трошкове је сложен производни процес Адено - придружених вируса (ААВ) вектора. Студија објављена у биотехнологији и биоингинеринг је развила метод романе пречишћавања комбинујући филтрацију тангенцијалних протока (ТФФ) са површински активним актима, што обећава да ће поједноставити поступак пречишћавања ААВ-а и смањење трошкова. Долазимо у ово истраживање које је водила тим са Универзитета у Токију.

 

1. Истраживачка позадина: Изазови и тренутни статус ААВ пречишћавања

ААВ Вецторс су постали алати за доставу "звезда" у генској терапији због своје високе безбедности, ниске имуногености, способности да се инфицирају и дељење и нон- дељење ћелија и капацитет - израз гена -. Међутим, њихов производни процес је сложен, посебно кораци пречишћавања низводно, који обично укључују више рунди центрифугирања и хроматографије. Ове методе су време - који ће конзумирати, порођај - интензивно, тешко за скалирање и скупо.

У лабораторијској скали, пречишћавање се често ослања на градијент цезијум хлорида или иодиканола ултрацентрифугирању, што је изазовно на скали за индустријску производњу. Афинитетна хроматографија се све више користи, али услови са ниским пХ је потребна могу да наруше вирусну инфективност. Стога је развијање једноставног, ефикасног, нежног и скалабилног метода пречишћавања ААВ је критично.

Филтрација тангенцијалних протока (ТФФ) је величина - заснована техника раздвајања која се обично користи за концентрацију и међуспремник - размјену биопродуката. Међутим, конвенционални ТФФ има ограничену способност уклањања нечистоћа као што су протеини домаћина (ХЦП) и ДНК током пречишћавања ААВ-а, често остављају протеински агрегати.

 

2. Иновативни приступ: ТФФ комбиновани са површински активним средствима за ефикасно пречишћавање

Превазићи ограничења традиционалног ТФФ-а, истраживача Рими Мииаока, Иуји Тсунекава и колеге на Универзитету у Токију: користећи сурверске стратегије да инхибирају агрегацију и интеракцију нечистоће протеина, омогућавајући им да прођу кроз ТФФ ултрафилтрацијску мембрану (500 кДам ултрафилтрацијској честици (~ 25 нм инхибира. Величина).

Тестирали су три врсте површински активних средстава:

• Не - јонски:Октил глукозид
• Анионски:Натријум деоксихолат
• ЗВИТТЕРОНИЦ:Гусари

Студија је открила да је само коришћење не-{0}} јонског сурфактанта неефикасан. И анионски натријум деоксихолат и зВиттериониц ЦХАПС значајно су побољшали уклањање преосталих протеина и циљали су различите протеинске популације. Коначно, комбиновање 0,5% натријум деоксихолата са 1% ЦХАПС произвели су изванредне резултате, готово у потпуности елиминише протеине заосталих домаћина. СДС - Анализа странице показала је само три Цлеар ААВ Цапсид Протеин бендови (ВП1 / ВП2 / ВП3).

 

Слика 1. Процес пречишћавања ТФФ-а без сурфактаната;(а) СДС - гел гел електрофореза; (б) Микроскопија за пренос електрона (тем)

 

Слика 1. Процес пречишћавања ТФФ са површински активним материјама;(а) СДС - гел гел електрофореза; (б) пренос електрона микроскопија (тем)

 

3. Резултати истраживања: Висока чистоћа, активност и сигурност

1. Ефикасно уклањање нечистоће:Нова метода је остварила 99,98% уклањања ХЦП-а и 95% уклањања ДНК, са чистоћом упоредивом са или прекорачењем афинитетне хроматографије.
2. Побољшана инфективност:Ин витро експерименти су показали да Аав1 вектори пречишћени коришћењем ове методе заражене ћелије ХЕК293 ефикасније од оних који су пречишћени афинитетом хроматографије (24,9% - 20,8%), што указује на бољу очување вирусне биоактивности.
3. Добро ин виво безбедност:Након локалне убризгавање пречишћених ААВ1 вектора у скелетни мишић миша, након две недеље није примећено значајно оштећење или оштећење ткива, демонстрирајући добру ин виво безбедност.
4. Броад Серотип применљивост:Метода је успешно пречишћала више серотипова - укључујући Аав1, Аав5, Аав8 и Аав9-из ћелијске културе. Међутим, за Аав2, који углавном постоји у ћелијским лизацима са високим оптерећењем нечистоћа, потребна је даља оптимизација.

 

4. Резиме и изгледи

Ова студија је развила једноставан, брз (1,5 сата), ефикасан и скалабилан нови ААВ поступак пречишћавања. Комбиновањем натријум деоксихолата и гусеница, успешно се бавио изазовом заосталог протеинског агрегације током прочишћавања ТФФ-а.

Предности методе укључују:

• Избегавање оштрих услова са ниским пХ, боље очување вирусне активности
• Смањење корака хроматографије, поједностављујући ток рада и штедње времена и трошкова
• Лако скалабилан, погодан за индустријски велики - Производња
• Пружање нове стратегије за пречишћавање других биомакромолекула као што су егзозоми, други вируси и рекомбинантни антитела

Тренутна ограничења укључују субоптимални вирусни опоравак и немогућност одвојених капсида из пуних вирусних честица, што сугерише да је њена најбоља употреба можда као прво - паприка у више- кораку прочишћавања.

Закључно, ово истраживање нуди атрактивну нову опцију за производњу низводне ААВ векторске производње и има потенцијал да значајно смањује трошкове лекова генске терапије, олакшавање њихове шире примене.