Примена ултрафилтрације у производњи вакцине против беснила

Да би се промовисала примена ултрафилтрације у производњи хумане вакцине против беснила, коришћена је ултрафилтрациона мембранска касета од 300 кДа за концентрисање раствора за сакупљање вируса беснила и откривање опоравка антигена, брзине уклањања ендотоксина и брзине уклањања протеина домаћина након ултрафилтрације. Резултати су показали да је под одговарајућим притиском раствор вируса беснила концентрисан 80 пута, елуиран 25 пута, стопа опоравка антигена је била 86.2%, стопа уклањања бактеријског ендотоксина 87.5% ~ 88.7% и стопа уклањања протеина домаћина била је 91,6%.

 

Предговор

 

Беснило је традиционална, древна зооноза изазвана вирусом беснила (РВ), са стопом смртности и до 100%. Тренутно не постоји ефикасан третман за постизлагање (тј. оштећење коже и слузокоже) осим хитне вакцине и вакцинације имуноглобулина. Главни извор беснила код људи су угризи болесних или потенцијално заражених животиња (углавном паса). Стопа смртности од беснила у Кини је на другом месту у свету, а беснило је један од проблема који угрожава јавноздравствену безбедност у нашој земљи. Капсуларни гликопротеин вируса беснила, који је једини кључни антиген који индукује производњу заштитних неутрализујућих антитела, био је у фокусу истраживања и развоја нових вакцина и нових технологија дијагностике и лечења вируса беснила.

 

Вирус беснила припада роду вируса беснила из породице рабдовируса. Облик нуклеокапсида је еластичан, нуклеокапсид је спирално симетричан, а површина има омотач који садржи једноланчану РНК. То је патоген који изазива беснило. Вирус беснила има два главна антигена: један је гликопротеински антиген на спољној мембрани вируса, који се може везати за рецептор ацетилхолина да би вирус учинио неуротоксичним, и производи неутрализујућа антитела и хемаглутинацију која инхибирају антитела у телу, а неутрализујућа антитела имају заштитни ефекат; Други је унутрашњи рибопротеински антиген, који може да натера тело да производи антитела која везују комплемент и преципитин, и нема заштитни ефекат.

 

Ендотоксин је врста липополисахаридне супстанце (ЛПС), која има отпорност на топлоту и хемијску стабилност и није лако уништити. Уколико постоји одређена концентрација ендотоксина у вакцини, то ће изазвати јаку температуру, па чак и смрт након вакцинације, па садржај ендотоксина у вакцини треба што више смањити. Издање Кинеске фармакопеје из 2005. (Део ИИИ) утврдило је да контролна вредност квалификованог индекса ендотоксина вакцине против беснила не би требало да буде већа од 100ЕУ/дози. Са брзим развојем технологије мембранске сепарације, примена технологије ултрафилтрационе мембранске сепарације за смањење садржаја ендотоксина у вакцинама постаје све распрострањенија у фармацеутској индустрији.

 

Вакцина против беснила је вакцина против беснила. Обично постоје три врсте вакцина против беснила, укључујући пречишћену вакцину Веро ћелије, вакцину са људским диплоидним ћелијама и вакцину за примарну ћелијску културу. Вакцина против беснила се прави инокулацијом вируса фиксираног вируса беснила у ћелијски матрикс, након културе, жетве, концентрације, инактивације, пречишћавања и додавања одговарајућег стабилизатора. Главна функција вакцине против беснила је да стимулише тело да произведе брзи имуни одговор и производи заштитна антитела против вируса беснила, како би се спречила инфекција изазвана вирусом и смањио ризик од болести.

 

 

Процес производње вакцине игра важну улогу у обезбеђивању квалитета вакцине, посебно је важнија квантификација неких показатеља у процесу производње. У процесу производње хумане вакцине против беснила, технологија концентрације ултрафилтрације је неопходно средство за производњу хумане вакцине против беснила. Коришћење ултрафилтрационе мембране разумног отвора за концентрацију ултрафилтрације може ефикасно уклонити ендотоксин и протеин домаћина и задржати РВ антиген, што је погодно за производњу вакцине и побољшање квалитета. Релативна молекулска маса РВ молекула је 350кДа ~ 460кДа, и у теорији, РВ може бити потпуно заробљен ултрафилтрационом концентрацијом помоћу мембранске касете са пресретном молекулском тежином од 100кДа и 300кДа. Ендотоксин често формира агрегатну структуру у различитим воденим растворима, због степена агрегације, величина молекула је различита. Релативна молекулска маса мономера ендотоксина је 10 кДа ~ 20 кДа, а релативна молекулска маса његовог полимеризационог облика је 300 кДа ~ 1000 кДа или више од 1000 кДа. На основу разлике у молекуларној тежини, РВ антиген у хуманој вакцини против беснила је задржан, а ендотоксин и протеин домаћина у хуманој вакцини против беснила су уклоњени ултрафилтрационом мембраном од 300 кДа.

 

У овом експерименту, ултрафилтрациона мембранска касета са отвором од 300кДа и површином мембране 0,11м2 коришћена је као третман малог узорка за концентрисање међупроизвода хумане вакцине против беснила и протока мембране, ефикасност третмана, вишеструка концентрација, пресретање антигена, уклањање ендотоксина , и тестирано је уклањање протеина домаћина.

 

2Материјална метода

 

2.1 Експериментални материјали

Вирус беснила фиксиран вирусом ЦТН-ИВ сој; Веро ћелије; 0.5М натријум хидроксида; 300кДа ултрафилтрациона мембранска касета (ПЕС материјал, површина мембране 0,11м²).

 

2.2 Експерименталне методе

2.2.1 Припрема раствора за сакупљање вируса

Замрзнуте Веро ћелије су оживљене у топлој води на 37 до 39 степени, ћелијска суспензија је испијана, а затим додата у 199 медијума културе који садржи 10% инактивираног телећег серума. Униформне једнослојне ћелије су култивисане на 37 степени. ЦТН-ИВ сој је инокулисан вирусом беснила у односу 0.1мол/Л и култивисан на 37 степени. После 48 х, медијум за културу је одбачен и додато је 199 медијума за културу који садржи 0,1% албумина из људске крви да би се култура одржала на 33 до 35 степени. Сакупите отров болести једном свака 3д-5д и комбинујте више течности за жетву.

 

2.2.2 Инсталирање мембранске касете

Инсталирајте мембранску касету и повежите ожичење као што је приказано на слици испод.

 

2.2.3 Прање водом

Затворите улазни вентил, повратни вентил и пролазни вентил и уметните повратни крај и крајњу цев у резервоар за отпадну течност. Напуните усисни резервоар са 1Л воде за ињекције.

Отворите улазни и повратни вентил, затворите пролазне вентиле, отворите пумпу, очистите повратни вод са 10% запремине пречишћене воде или воде за убризгавање и одржавајте улазни притисак на 0,35 бара (5 пси).

Отворите вентил филтера, затворите повратни вентил и користите преосталу воду за убризгавање да очистите филтерску цев, одржавајући ТМП на 0.35 бара.

 

2.2.4 Дезинфекција

Затворите улазни вентил, повратни вентил и вентил преноса и уметните повратни крај и крајњи водови преноса у резервоар за отпадну течност. Напуните усисни резервоар са 2Л раствора за чишћење.

Отворите улазни и повратни вентил, затворите пролазне вентиле, отворите пумпу, очистите повратни вод са 200мЛ 0,5М натријум хидроксида и одржавајте улазни притисак на 0,35 бара (5пси) .

Отворите пролазни вентил, затворите повратни вентил и очистите пролазну цев са 200мЛ запремине раствора за чишћење, одржавајући ТМП на 0,35 бара.

Затим се повратни крај и пролазна цев убацују у резервоар за течност за циклично чишћење. Циклусно чишћење са 1 ~ 1,5 пута већом брзином тангенцијалног протока током 30 мин.

Оцедити 0.5М натријум хидроксида и испрати водом за ињекције у складу са 2.2.4 до неутралног стања.

 

2.2.5 Испитивање протока воде

Додајте пречишћену воду у усисни резервоар, измерите и забележите температуру воде у усисном резервоару. Уметните повратни крај у резервоар. Покрените пумпу и подесите брзину пумпе и повратни вентил да бисте постигли разлику трансмембранског притиска од 0.35 бара (5 пси). Користећи цилиндар, измерите и забележите брзину протока на крају у мл/мин. Подесите брзину пумпе и повратни вентил да добијете трансмембрански диференцијални притисак од 1 бар (15 пси). Користећи цилиндар, измерите и забележите брзину протока на крају у мл/мин.

Да бисте стандардизовали вредност протока воде, поделите израчунату вредност протока воде са разликом трансмембранског притиска и помножите фактор корекције температуре у следећој табели.

 

2.2.6 Концентрација ултрафилтрације

Исперите воду из система са врхом пуфера. Циклусирајте 5 минута да бисте подесили пХ и стабилност јона система. Ако је потребно подесити температуру, наставите циклус док температура система не буде стабилна.

Додајте доводну течност у усисни резервоар, подесите проток хране (нпр. 400ЛМХ) и тестирајте проток на различитим вредностима ТМП. Према подацима теста, криве су нацртане са ТМП као апсцисом и Флуком као ординатом.

Усмерите цев кроз крај у одговарајући контејнер или одвод, као што су резервоари за сакупљање преко краја, резервоари за отпадну течност и процесни одводи.

Забележите почетну тежину напојне течности у резервоару за напајање, покрените пумпу за напајање и полако циркулишите напојну течност 3 мин до 4 мин. Рециркулација може помоћи у уклањању заосталог ваздуха на путу протока, чиме се максимизира учинак филма.

Отворите пролазни вентил, полако повећавајте брзину пумпе док се не постигне оптимални тангенцијални проток и подесите повратни вентил да бисте постигли оптимални ТМП система.

Затим ставите епрувету у контејнер за сакупљање, почните да мерите време када течност уђе у посуду, и забележите улазни и повратни притисак у одговарајућим интервалима, и забележите квалитет течности током времена на повратном и пролазном крају да бисте израчунали тренутни проток.

Ултрафилтрациона концентрација узорка је завршена када се запремина течности хране смањи на запремину циљне концентрације.

 

2.2.7 Дијализа

Ставите усисну цев, цев за допуњавање и повратну цев у усисни резервоар, ставите преносну цев у контејнер за сакупљање и ставите посуду за сакупљање на вагу да се очисти.

Отворите повратни вентил, покрените улазну пумпу, отворите пролазни вентил, подесите брзину пумпе и ТМП на одговарајућу вредност. Отворите пумпу за допуњавање, задржите запремину течности у усисном резервоару непромењеном и започните дијализу једнаке запремине. Започните мерење времена када течност уђе у посуду и забележите притисак на улазном крају, повратном крају и масу течности у одговарајућем временском интервалу и израчунајте тренутну брзину протока.

 

2.2.8 ЦИП

Прво исперите пуфером, затим исперите водом за ињекције (операција 2.2.3), затим очистите средством за чишћење (операција 2.2.4), и на крају исперите водом за ињекције (операција 2.2.3).

 

2.2.9 Испитивање протока воде

Операција је следећа: 2.4.5.

 

2.2.10 Очување мембранске касете

Краткотрајно складиштење (мање од или једнако 3 дана), држите мембранску касету у фиксацији и користите раствор за складиштење за циклус од 10 до 15 минута, затворите вентил система, искључите напајање пумпе за течност и осигурајте да је резервоар за довод течности правилно затворен.

Ако је време складиштења од 3 дана до 1 месеца, уклоните мембранску касету из уређаја и затворите је у пластичну кесу или другу херметичку посуду. Додајте око 50мЛ до 100мЛ раствора за складиштење у пластичну кесу или херметички затворену посуду и затворите је. Или се може директно уронити у раствор за складиштење. Следећа табела препоручује услове складиштења.

 

3 Резултати и анализа

 

3.1 Испитивање фактора утицаја на ефикасност уклањања пирогена

Радни притисак ултрафилтрације: 15 тест серија је вођено континуирано. У свакој серији, притисак филтрације је одржаван на 5, 10, 15 и 2{{10}}пси током ултрафилтрације, а течност за сакупљање вируса је концентрисана 30 пута и елуирана пуферском течношћу (10 пута већи волумен) у непрекидном току. Резултати као што је приказано у табели испод, стопа уклањања ендотоксина је била мања од 87,0%, стопа опоравка антигена је била стабилна на 86,0%, а стопа уклањања протеина домаћина била је стабилна на 90,0%, што указује да су различити радни притисци имали мали утицај на ефекат опоравка антигена, уклањања ендотоксина и уклањања протеина домаћина.

Однос концентрације ултрафилтрације: 15 тест серија је вођено континуирано. У свакој серији, течност за сакупљање вируса је концентрисана 30 пута, 50 пута, 80 пута и 100 пута, респективно, током ултрафилтрације. Притисак филтрације је одржаван на 20 пси, а пуферска течност (10 пута већа запремина) је елуирана у континуираном току. Резултати као што је приказано у следећој табели, стопа уклањања ендотоксина кретала се од 53,3% до 86,9%, стопа опоравка антигена је остала стабилна на 86,0%, а стопа уклањања протеина домаћина био стабилан на 91,0%. У сегментираном узорковању, антиген није откривен у раствору за трансмисију, а мање од 10% протеина домаћина је остало у концентрованом раствору вируса. Концентрација ендотоксина у концентрованом раствору вируса се повећавала са повећањем времена концентрације, а брзина уклањања ендотоксина била је највећа у концентрованом узорку од 80 пута, а произвођач је могао узети у обзир и концентрацију од 100 пута, што не само да побољшала ефикасност производње и смањила трошкове, али и испунила захтеве производње вакцина.

 

3.2 Смањење флукса мембранске касете и регенерација чишћења

Након третмана, стопа опоравка мембранског флукса била је 92,6%. Прва стопа опоравка нове мембранске касете је нормална, према тренутним особинама посматрања напојне течности, накнадно предвиђање другог и НТХ пута, стопа опоравка флукса мембранске касете биће блиска подацима након овог третмана, и имају тенденцију да буду стабилни. У року од 2 сата од једнократне употребе, исцрпљивање мембранске касете је било идеално, а само 10% мембранског флукса је исцрпљено током целокупног рада.

3.2.1 Смањење флукса у процесу обраде мембранске касете

3.2.2 Резултат чишћења и регенерације мембранске касете

 

О Гуидлингу

 

Гуидлинг Тецхнологи је национално високотехнолошко предузеће које се фокусира на биофармацеутике, ћелијску културу, пречишћавање и концентрацију биомедицине, дијагностику и индустријске течности. Успешно смо развили центрифугалне филтерске уређаје, касете за ултрафилтрацију и микрофилтрацију, филтер за вирусе, ТФФ систем, дубински филтер, шупља влакна, итд. Који у потпуности испуњавају сценарије примене биофармацеутика, ћелијске културе и тако даље. Наше мембране и мембрански филтери се широко користе у концентрацији, екстракцији и одвајању предфилтрације, микрофилтрације, ултрафилтрације и нанофилтрације. Наше бројне линије производа, од малих, за једнократну употребу лабораторијске филтрације до производних система филтрације, тестирања стерилности, ферментације, ћелијске културе и још много тога, задовољавају потребе тестирања и производње. Гуидлинг Тецхнологи се радује сарадњи са вама!