Примена ултрафилтрације у екстракцији природног колагена

Колаген, као природни протеински ресурс, има добру биокомпатибилност, ниску антигеност, биоразградљивост и хемостазу, своју чврсту спиралну структуру и сопствене карактеристике, а све то ствара предуслове за његову индустријализацију. Колаген и његови нуспроизводи се не користе само као материјали за паковање, козметика и производи за здравствену негу, већ и као адитиви у храни за побољшање месних производа, а игра важну улогу, посебно у области медицине.

 

Шта је колаген?

 

Колаген је биолошки макромолекул, главна компонента животињског везивног ткива и најзаступљенији и најраспрострањенији функционални протеин код сисара, који чини 25% до 30% укупног протеина, па чак и до 80% или више у неким организмима. Он игра улогу везивног ткива у животињским ћелијама.

Измерено је да тело одрасле особе има око 3 кг колагена, који углавном постоји у људској кожи, костима, очима, зубима, тетивама, унутрашњим органима (укључујући срце, желудац, црева, крвне судове) и другим деловима људског тела. функција је одржавање морфологије и структуре коже и ткива и органа, а такође је важна сировина за поправку различитих ткива након повреда.

 

Постоји много врста протеина колагена, а уобичајени типови су тип И, тип ИИ, тип ИИИ, тип В и КСИ. Због своје добре биокомпатибилности, биоразградљивости и биоактивности, колаген се широко користи у храни, медицини, ткивном инжењерству, козметици и другим пољима.

Како извући природни колаген

Животињска ткива од стоке и живине су главни начин да људи добију природни колаген и његове колагене пептиде. Међутим, због сродних животињских болести и одређених верских уверења, употреба колагена и његових производа из копнених сисара је ограничена, а развој се постепено окреће морским организмима. Европска агенција за безбедност хране (ЕФСА) потврдила је да чак ни колаген добијен из животињских костију нема потенцијал да зарази кравље лудило и друге сродне болести. Због разлика у саставу аминокиселина и степену умрежавања, водене животиње, посебно колаген богат отпадом од њихове обраде као што су кожа, кости и каменац, имају многе предности које колаген стоке нема. Поред тога, колаген добијен од морских животиња је очигледно супериорнији од колагена копнених животиња у неким аспектима, као што су ниска антигеност и хипоалергеност. Стога, водени колаген може постепено заменити колаген копнених животиња. Као пример узет је процес екстракције колагена из крљушти амура.

 

Екстракција колагена из крљушти амура методом ултрафилтрације

1. Материјали и методе

1.1 Тест узорак

Водени екстракт сировог колагена.

1.2 Методе испитивања

1.2.1 Пут процеса ултрафилтрације

 

1.2.2 Одређивање процеса пре филтрације

У овом тесту, метода вакуум филтрације и метода микрофилтрације се упоређују и анализирају како би се одредио најбољи процес филтрације пре филтрације. Специфичне методе испитивања су следеће:

① Водени екстракт сировог колагена је филтриран вакуумским пумпањем филтер папира да би се уклониле суспендоване честице и нечистоће у воденом екстракту.

② Сирови водени екстракт колагена је филтриран помоћу 0.2μм микрофилтрационе мембране да би се уклониле нерастворљиве материје и нечистоће у воденом екстракту.

 

1.2.3 Избор величине пора ултрафилтрационе мембране

Величина пора ултрафилтрационе мембране била је 100 кДа.

 

1.2.4 Експеримент са једним фактором процеса ултрафилтрационог пречишћавања

За пречишћавање сировог воденог екстракта колагена коришћена је технологија ултрафилтрације, а проучавани су једнофакторски експерименти о утицају радног притиска, радне температуре и пХ вредности на задржавање колагена. Након што је ултрафилтрациона опрема пуштена у рад на одређено време и стабилизована, проучаван је утицај различитих фактора на задржавање колагена.

 

1.2.5 Формула за израчунавање

 

2. Резултати и анализа

2.1 Резултати анализе процеса предфилтрације

Резултати поређења две методе филтрације вакуум екстракције и микрофилтрације приказани су у следећој табели.

 

Из табеле се може видети да и методом вакуум филтрације и методом микрофилтрације могу се уклонити нечистоће и нерастворљиве чврсте материје у раствору, али метода микрофилтрације има бољи заштитни ефекат на протеине, односно губитак није очигледан, а метода вакуумске филтрације је лако изазвати губитак протеина. Поред тога, метода вакуумске филтрације појављује се замућеност након постављања филтрата на одређено време, а микрофилтрат је и даље бистар и провидан, тако да је микрофилтрација изабрана као процес предтретмана ултрафилтрације.

 

2.2 Једнофакторски тест процеса ултрафилтрације

2.2.1 Утицај притиска ултрафилтрације на брзину задржавања

Под условима температуре 40 степен и пХ=9.0, утицај различитих ултрафилтрационих притисака (0.07МПа, {{9} }.09МПа, 0,11МПа, 0,13МПа и 0,15МПа) на задржавање протеина. Резултати су приказани на слици испод.

Као што се може видети са горње слике, са повећањем радног притиска, стопа задржавања протеина постепено се смањује. Када је радни притисак {{0}}.07МПа, стопа задржавања протеина је 96,53%, а када је радни притисак 0,15МПа, стопа задржавања протеина је 84,38%. То је зато што се ефекат одвајања ултрафилтрације на супстанце врши разликом притиска. У опсегу ниског радног притиска, мали молекули могу брзо да прођу кроз мембрану, док велики молекули могу да буду заробљени ултрафилтрационом мембраном и акумулирају се на површини мембране. У овом тренутку, површина мембране и водени екстракт формирају концентрацијску разлику, што резултира отпором поларизације концентрације. У овом тренутку, притисак је релативно низак и не може имати велики утицај на стопу задржавања. Међутим, са повећањем притиска, концентрацијски поларизациони отпор постепено расте, а разлика концентрације између површине мембране и воденог екстракта достиже равнотежу. Када притисак пређе ову равнотежу, може се формирати слој гела на површини мембране (што је у складу са теоријом да се током ултрафилтрације формирају поларизација концентрације и кондензациони слој), а притисак наставља да расте, дебљина слоја гела се повећава. , а повећава се и протеин који остаје на површини мембране. Ово резултира нижом стопом задржавања. Да би се обезбедио ефекат раздвајања мембране, оптимални параметар радног притиска је 0,07МПа.

 

2.2.2 Утицај температуре на задржавање протеина

У условима {{0}}.11МПа притиска и пХ=9.0, ефекти различитих температура, односно 25 степени, 30 степени, 35 степени, 40 степени и 45 степени, на протеине проучавано је задржавање. Резултати су приказани на слици испод.

Као што се може видети са горње слике, стопа задржавања ултрафилтрационе мембране постепено расте са порастом температуре, и достиже максимум на 45 степени, са стопом задржавања од 97,01%. То је зато што је вискозитет колагена уско повезан са температуром. Када је температура ниска, вискозност колагена је већа, а акумулација колагена на површини мембране лако се ствара отпор, што резултира ниском стопом задржавања. Када се температура повећа, вискозност колагена се смањује, интеракција између молекула колагена је ослабљена, а брзина преноса масе се повећава, феномен поларизације концентрације је ослабљен, а стопа задржавања се повећава. Други разлог за повећање стопе задржавања је што се температура повећава, сходно томе се повећава и растворљивост колагена, а смањује се и феномен блокирања колагена мембране, па је оптимална температура ултрафилтрације 45 степени.

 

2.2.3 Утицај пХ вредности на задржавање протеина

У условима {{0}}.11МПа притиска и температуре од 40 степена, утицај различитих пХ услова, односно пХ=6.0, пХ{{ 5}}.{{10}}, пХ=8.0, пХ=9.0 и пХ=10.0, о стопи задржавања. Резултати су приказани на слици испод.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, стопа задржавања се постепено повећава са повећањем пХ вредности. То је зато што је ултрафилтрациона мембрана мембрана од полиетера јавора са негативним набојем, а колаген је негативно наелектрисан у алкалним условима. Негативно наелектрисани молекули колагена формирају међусобно искључено стање са ултрафилтрационом мембраном са истим набојем, тако да молекулима колагена није лако да остану на површини мембране и блокирају мембрану. Стога је оптимална пХ вредност ултрафилтрације 8-10.

 

2.3 Оптимизација процеса ултрафилтрације и верификација резултата

Према анализи софтвера Десигн-Екперт8.05, оптимални параметри процеса су: радни притисак 0.14МПа, радна температура 40.98 степени, пХ раствора{{7 }}.43, а стопа задржавања је 92,551%. Узимајући у обзир операбилност стварних параметара, изабрани су услови ултрафилтрације као радни притисак 0,14МПа, радна температура од 40 степени и пХ вредност раствора материјала 9,50, а тестна верификација је започета након покретања и стабилизације система ултрафилтрације. Резултат стопе задржавања био је (92,61±0,1) % (н=3). Предвиђене вредности једначине су у основи сличне измереним вредностима, што показује да су резултати параметра предвиђеног стања у сагласности са резултатима стварних услова.

 

2.4 Резултати електрофоретске анализе

Пречишћени колаген је анализиран СДС-ПАГЕ електрофорезом, а резултати су приказани на следећој слици.

 

Као што се може видети са горње слике, трака 1 је пречишћени колаген овог теста, а трака 2 је стандардни узорак колагена телеће тетиве. Из СДС-ПАГЕ електрофорезе се може видети да се колаген у овој студији може идентификовати као колаген, али границе између а1 пептидног ланца и а2 пептидног ланца изгледа да нису јасне. Из електрофоретске карте се види да нема друге протеинске нечистоће, па се може закључити да је пречишћени колаген високе чистоће.

О Гуидлингу

 

Гуидлинг Тецхнологи је национално високотехнолошко предузеће које се фокусира на биофармацеутике, ћелијску културу, пречишћавање и концентрацију биомедицине, дијагностику и индустријске течности. Успешно смо развили центрифугалне филтерске уређаје, касете за ултрафилтрацију и микрофилтрацију, филтер за вирусе, ТФФ систем, дубински филтер, шупља влакна, итд. Који у потпуности испуњавају сценарије примене биофармацеутика, ћелијске културе и тако даље. Наше мембране и мембрански филтери се широко користе у концентрацији, екстракцији и одвајању предфилтрације, микрофилтрације, ултрафилтрације и нанофилтрације. Наше бројне линије производа, од малих, за једнократну употребу лабораторијске филтрације до производних система филтрације, тестирања стерилности, ферментације, ћелијске културе и још много тога, задовољавају потребе тестирања и производње. Гуидлинг Тецхнологи се радује сарадњи са вама!