Студија о процесу бистрења ферментационог лизата високе густине рекомбинантне Есцхерицхиа Цоли
Да би се смањила интерференција материјалне течности на хроматографију и побољшао опоравак циљног протеина, проучаван је процес бистрења ферментационог лизата високе густине два соја рекомбинантне Есцхерицхиа цоли. Одабрани су сојеви БЛ21-ХП1036 и БЛ21-палА који експримирају кључне гене Стрептоцоццус суис и Хаемопхилус парасуис. Процес тангенцијалног тока, процес центрифугирања велике брзине и процес бистрења мембранске касете коришћени су за процену приноса протеина детекцијом замућености и електрофорезом.
Резултати су показали да су БЛ21-ХП1036, БЛ21-палА ферментациони лизат високе густине који експримирају кључне гене Стрептоцоццус суис и Хаемопхилус парасуис разбистрени филтрацијом и центрифугирањем мембранске касете, а принос протеина је био преко 80%. што би могло ефикасно да смањи хроматографске сметње и побољша стопу опоравка.
Увод
Тренутно су Стрептоцоццус суис (СС) и Хаемопхилус парасуис (ХПС) најчешћи узрочници бактеријских болести на фармама свиња, који доносе велике губитке индустрији свиња. СС се може поделити на укупно 35 серотипова 1-34 и 1/2, а ХПС се може поделити на 1-15 серотипове, а ова два се често мешају, углавном изазивајући полисерозитис код свиња, артритис, менингитис, ендокардитис , бактеријска септикемија и бронхитис.
Због великог броја серотипова Стрептоцоццус суис и Хаемопхилус парасуис, унакрсна заштита између различитих серотипова је слаба, а резистенција на антибиотике ће се значајно повећати када се лечи антибиотицима, што ће утицати на терапијски ефекат.
Вакцине су постале једно од ефикасних средстава за превенцију СС и ХПС. Постоје инактивиране вакцине, атенуиране вакцине, живе вакцине, подјединичне вакцине и генетски модификоване вакцине, али инактивиране вакцине и атенуиране вакцине су углавном на тржишту, и њихова имунолошка заштита је добра, али унакрсна заштита није очигледна. Субјединична вакцина је нова врста вакцине против стрептоцоццус суис, која је нова врста вакцине са јаком унакрсном заштитом и ниском ценом. Истраживање и развој подјединичних вакцина против Стрептоцоццус суис и Хаемопхилус парасуис пружа савршено решење за превенцију и контролу проблема Стрептоцоццус суис и Хаемопхилус парасуис који муче индустрију свиња у Кини.
Стрептоцоццус суис и Хаемопхилус парасуис подјединичне вакцине су подвргнуте ферментацији високе густине помоћу рекомбинантне Есцхерицхиа цоли. Појашњење лизата има велики утицај на принос циљних протеина, али постоји неколико релевантних извештаја. Како реализовати корак бистрења процеса ферментације и пречишћавања је важан посао. У овом раду, рекомбинантна Е. цоли БЛ21-ХП1036, БЛ21-палА ферментација високе густине као предмет, да се проучи како ефикасно смањити замућеност раствора за бистрење, побољшати принос протеина, за Процес ферментације подјединичне вакцине Стрептоцоццус суис да би се постигла технологија индустријског дробљења и бистрења ради обезбеђивања теоријске основе и техничке подршке.
1. Материјали и методе
1.1 Материјали
1.1.1 Сојеви
Стрептоцоццус суис и Хаемопхилус парасуис сојеви БЛ21-ХП1036, БЛ21-па-лА
1.1.2 Главни медијум и реагенси
Екстракт квасца и плискавица; Натријум хлорид; Канамицин, ИПТГ; Формалдехид из; СДС-ПАГЕ гел комплет.
1.1.3 Главна опрема за испитивање
Ферментор високе густине; Центрифуга велике брзине; Апарати за електрофорезу; Ултраљубичасти гел систем за снимање; Ултразвучна дробилица; Мала центрифуга велике брзине; Ултраљубичасти спектрофотометар; Сто за протресање константне температуре; Опрема за афинитетну хроматографију.
1.2 Методе
1.2.1 Култура ферментације високе густине
Квалификовани рекомбинантни сојеви колиформа БЛ21-ХП1036 и БЛ21-па-лА су инокулисани на синтетичком медијуму при 2% (В/В) и култивисани на 37 степени током 35-40 х.
1.2.2 Експресија изазвана рекомбинантним протеином
Када је раствор за ферментацију ОД{{0}}±0.1, индукција је почела, температура индукције је била 35 степени ±0,5 степени, а култура је завршена након 10 сати индукције.
1.2.3 Хомогено дробљење и центрифугирање под високим притиском
Бактеријска течност која је прошла тест инактивације је дробљена помоћу хомогенизатора високог притиска за пуцање ћелија, респективно, са притиском од 100~150 МПа. Након дробљења, згњечена течност је држана на ниској температури.
Супернатант је добијен центрифугирањем великом брзином, центрифугална брзина: 15000 рпм, контрола температуре: 10 степени ~15 степени, брзина убризгавања: 0,5~1 Л/мин, респективно, супернатант је сакупљен и супернатант је напуњен контејнерима који су уклонили ендотоксин.
1.2.4 Прочишћавање касете са микрофилтрационом мембраном
Мембрана је испрана са 10Л пречишћене воде у једном правцу и извршена је филтрација тангенцијалног тока. 300 мЛ разбијене бактеријске суспензије након центрифугирања је узето из цевоводне центрифуге и бистрено са 0,45 ум микрофилтрационом мембранском касетом. Замућеност је мерена узорковањем респективно, а упоређивани су замућеност након центрифугирања, замућеност прочишћене течности у касети са микрофилтрационом мембраном и замућеност концентроване течности у касети са микрофилтрационом мембраном. Садржај протеина у узорку је детектован хроматографијом и електрофорезом да би се проценио принос протеина.
Корак 2: Резултати
2.1 Подаци за појашњење и резултати испитивања БЛ21-ХП1036 и БЛ21-палА протеина
Резултати на Сл. 1 показује да је замућеност БЛ21-ХП1036 и БЛ21-палА рекомбинантне Есцхерицхиа цоли течности за дробљење смањена са 4 500 НТУ и 4 000 НТУ на 1970 НТУ и 520 НТУ, респективно, након центрифугирања епрувете. Замућеност БЛ21-ХП1036 и БЛ21-палА рекомбинантне Есцхерицхиа цоли смањена је на 25 НТУ и 1,28 НТУ методом микрофилтрационе мембранске касете. Може се видети да употреба тангенцијалног протока касетне микрофилтрационе мембране и оптимизованог отвореног канала протока има добар ефекат на смањење ендотоксина, вискозитета и замућености хроматографске течности у односу на традиционалну филтрацију центрифугом, и може значајно да смањи сломљени рекомбинантни хетеропротеин Е. цоли и нуклеинске киселине.
2.2 Опоравак протеина узорака БЛ21-ХП1036 и БЛ{{4}палА
Табела 1 показује да рекомбинантни протеин Есцхерицхиа цоли БЛ21-ХП1036 постоји и у микрофилтрационом бистреном раствору и у концентрованом супернатанту прекривеном микрофилтрационом мембраном, као и укупан принос протеина након добијања протеина из бистреног раствора микрофилтрацијом и концентрованог супернатанта износи око 88,5%. БЛ21-палА протеин је такође постојао у бистреном раствору ексудата микрофилтрације и супернатанту концентрованог раствора прекривеном касетом за микрофилтрациону мембрану. Укупан принос БЛ21-ПАЛа протеина био је 81,5%.
3. Закључак
У овом раду, сојеви који експримирају кључне гене БЛ{{0}}ХП1036 и БЛ21-палА Стрептоцоццус суис и Хаемопхилус парасуис су подвргнути ферментацији високе густине и прошли су 0,45 Замућеност течности материјала је била значајно смањен процесом касете са микрофилтрационом мембраном, што указује да је технологија филтрације тангенцијалног протока са микрофилтрационом мембранском касетом била боља од оне са центрифугом велике брзине, и могла би значајно да смањи нечистоћу протеина и нуклеинске киселине сломљене рекомбинантне Есцхерицхиа цоли.
Након сакупљања бистре течности у једној касети са микрофилтрационом мембраном, било је 62,9% јер је 37,1% циљног протеина БЛ21-ХП1036 било концентрат микрофилтрације или је постојало у касети са мембраном за микрофилтрацију и други губици , за појашњење је усвојена метода у два корака. У првом кораку, 0,45ум микрофилтрациона мембранска касета је коришћена да би се разбистрио и сакупио ексудат; у другом кораку, преостала концентрована течност је сакупљена након центрифугирања у епрувети, а двостепена бистрена течност је комбинована као хроматографски узорак. Вредност замућености БЛ21-палА ферментационе течности се није значајно повећала, принос протеина је могао да достигне више од 85,5%, а принос протеина БЛ21-Пала ферментационе течности могао би да достигне 81,5% након третмана у два корака.
Што се тиче избора касете са микрофилтрационом мембраном, Гуидлинг Тецхнологи вам може пружити висококвалитетна решења. Наши производи серије касета за микрофилтрациону мембрану и касете са ултрафилтрационом мембраном користе полиетер сулфон као носач, посебно дизајниран за биотехнологију. Наша полиетер сулфонска мембрана има предности високе пропусности, ниске адсорпције протеина, високе механичке чврстоће, отпорности на ударце и тако даље. Пружамо вам специјалне мембранске стезаљке за мерење притиска на улазу и излазу у реалном времену и можемо да обезбедимо техничке посете у складу са вашим потребама како бисте прилагодили ваш специјални систем ултрафилтрације/микрофилтрације. Такав систем малог тангенцијалног протока може се користити за малу, пилотску и малу производњу, и може бити потпуно линеарно појачање како би се у потпуности испунили ваши тестни захтеви и захтеви производње.
О Гуидлингу
Гуидлинг Тецхнологи је национално високотехнолошко предузеће које се фокусира на биофармацеутике, ћелијску културу, пречишћавање и концентрацију биомедицине, дијагностику и индустријске течности. Успешно смо развили центрифугалне филтерске уређаје, касете за ултрафилтрацију и микрофилтрацију, филтер за вирусе, ТФФ систем, дубински филтер, шупља влакна, итд. Који у потпуности испуњавају сценарије примене биофармацеутика, ћелијске културе и тако даље. Наше мембране и мембрански филтери се широко користе у концентрацији, екстракцији и одвајању предфилтрације, микрофилтрације, ултрафилтрације и нанофилтрације. Наше бројне линије производа, од малих, за једнократну употребу лабораторијске филтрације до производних система филтрације, тестирања стерилности, ферментације, ћелијске културе и још много тога, задовољавају потребе тестирања и производње. Гуидлинг Тецхнологи се радује сарадњи са вама!
